1. Различия между конститутивными и индуцибельными факторами

разделить все защитные механизмы на конститутивные и индуцибельные. Следует отметить, что в совре­менной учебной литературе (вероятно, как следствие переводов с анг­лийского) синонимами термина конститутивные в этом контексте могут являться термины «природные» (от англ. natural) и «врожденные» (от англ. innate). Аналогично для обозначения индуцибельных защитных ме­ханизмов могут применяться термины «приобретенные» (от англ. ac­quired) и «приспособительные» (от англ. adaptive).

Отличительными чертами конститутивных (врожденных) за­щитных механизмов являются их постоянное присутствие в организме вне зависимости от действия дестабилизирующих факторов и отсутствие выраженной специфичности, т. е. сходность проявления при действии различных факторов. Такого рода защитные механизмы способны одно­временно защищать организм от целого ряда факторов практически сра­зу после рождения. В то же время индуцибельные защитные реакции отсутствуют в организме изначально, возникают в течение жизни в ре­зультате контакта с конкретным дестабилизирующим фактором и обла­дают ярко выраженной специфичностью, т. е. защищают только от того фактора, который и вызвал проявление этого механизма.

Следует подчеркнуть, что в целом подобного рода разделение за­щитных механизмов достаточно условно, поскольку при воздействии любого из дестабилизирующих факторов защищающийся организм включает все необходимые защитные механизмы, и, как правило, меха­низмы, относимые к конститутивным, стимулируют развитие индуци- бельных, а эффективность конститутивных изменяется в зависимости от присутствия и степени выражения индуцибельных. Тем не менее, можно считать, что конститутивные защитные механизмы являются первым барьером или эшелоном защиты от биологической агрессии, а индуци- бельные - вторым, поскольку они, как правило, включаются только то­гда, когда первый барьер в той или иной степени преодолевается.

К конститутивным защитным барьерам традиционно относят не­проницаемость покровов, лизоцим, гидролитические ферменты и соляную кислоту желудочно-кишечного тракта, интерферон, воспа­ление, фагоцитоз, систему комплемента и другие присутствующие в крови гуморальные факторы конститутивной защиты.

Индуцибельные защитные механизмы - это все формы иммунного ответа, основанные на специфическом распознавании чужеродных анти­генов. Как правило, для их реализации требуется гораздо больше време­ни, чем для проявления конститутивных факторов защиты, а также обя­зательным является участие иммунокомпетентных клеток. Основными и наиболее изученными среди них являются: ответ на тимусзависмые антигены, приводящий к появлению специфических антител и соот­ветствующих клеток иммунной памяти; действие Т-киллеров, огра­ниченных по молекулам главного комплекса гистосовместимости; гиперчувствительность замедленного типа; гиперчувствительность немедленного типа.

2. Роль антигенпредставляющих клеток

3. Основные разновидности реакций преципитации. Применение в биологии

Реакции преципитации

Такие реакции используются для так называемых высокодисперсных антигенов, представляющих собой отдельные молекулы. Основные отличия их от реакций агглютинации заключаются в более медленном (как правило) образовании осадка (преципитата), меньшей его плотности и способности со временем диссоциировать.

Наиболее быстрый вариант (экспресс-метод) преципитации - это реакция кольцепреципитации. Для ее постановки используют специальные узкие пробирки, обычно называемые преципитационными. Небольшой диаметр таких пробирок должен препятствовать смешиванию двух растворов, содержащих соответственно антиген и антитела. Необходимо, чтобы оба раствора были прозрачны и не содержали видимых взвешенных частиц. Сначала в пробирку до половины объема наливают один из растворов, а затем медленно по стенке, не допуская перемешивания с уже налитым раствором, приливают второй в таком же объеме. В результате диффузии молекул антигена и антител будут создаваться меняющиеся соотношения концентраций, и, когда они окажутся эквивалентными, образуется располагающийся на границе двух растворов осадок, обычно имеющий форму кольца, что и дало название реакции. Обычно кольцо образуется в течение 5-15 мин, но затем из-за продолжающейся диффузии концентрации выйдут из зоны эквивалентности, комплексы антиген- антитело начнут диссоциировать и кольцо осадка может исчезнуть. Поэтому учитывать результат такой реакции следует не позже, чем через час после ее постановки, что в целом считается одним из ее недостатков.

С целью избежать диссоциации образующихся осадков были разработаны варианты реакций преципитации в гелях, получившие название реакций иммунодиффузии. Используемые для таких реакций гели чаще всего готовят из агара или агарозы в концентрациях от 1 % до 2 % на веронал-ацетатном буфере с рН 6,8 и ионной силой 0,1. Нагретый гелеобразующий раствор наносят слоем равной толщины на прозрачную стеклянную или пластиковую пластинку или дно чашки Петри и после застывания в геле изготавливают лунки равной глубины и диаметра. В зависимости от варианта реакции в лунки будут вноситься растворы антигенов или антител, при диффузии которых в геле будут создаваться эквивалентные концентрации. Хотя такая диффузия будет происходить медленнее, чем в жидкостях, что удлиняет время протекания реакций, образующиеся в геле осадки сохраняются гораздо большее время. Кроме того, можно улучшить визуализацию результатов проведенной реакции путем обработки гелей раствором связывающихся с белками красителей (например, Кумасси синего).

Одним из наиболее распространенных вариантов таких реакций явля­ется двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (ил. 47). Для постановки реакции в разные лунки, расположенные на расстояниях 4-10 мм друг от друга, вносят суспензии антигенов и антител. Молекулы реагентов диффундируют в гель, и в случае соответствия антигена и ан­титела в геле между лунками образуется полоска преципитата. Иммуно- диффузия получила название двойной в силу того, что оба компонента движутся в геле навстречу друг другу. Результаты учитывают каждые 24 часа в течение 6-7 суток. Время образования преципитатов варьирует в зависимости от температуры инкубирования гелей (реакцию можно про­водить при +4°С, +18-20°С или +37°С) и от молекулярной массы антиге­нов.

Метод позволяет анализировать сыворотки на содержание антител различной специфичности. В этом случае вокруг одной заполняемой сывороткой лунки располагаются лунки, в которые вносятся различные антигены. По сходной схеме возможно определить наличие в анализируемом растворе нескольких различных антигенов, но в этом случае анализируемый раствор вносят в центральную лунку, а лунки вокруг заполняют различными моноспецифическими сыворотками. При наличии двух или более полос между конкретными лунками делается вывод о наличии в анализируемых смесях нескольких антигенов, способных связываться с антителами сыворотки, но обладающих различной скоростью диффузии. По ширине образующихся полос преципитата можно предположительно оценивать разницу в концентрациях того или иного реагента в анализируемых смесях, однако этот метод не является истинно количественным.

Для определения количества реагирующих компонентов используется простая радиальная иммунодиффузия по Манчини (ил. 48). Для по­становки этой реакции один из компонентов (например, антитела) вносят в гелеобразующий раствор до застывания и перемешиванием добиваются равномерного его распространения. После застывания геля в слое обра­зуется одинаковая концентрация этого компонента в любой точке геля. После изготовления лунок их заполняют растворами, содержащими вто­рой компонент (в нашем примере молекулы антигена). В данном случае диффундирующим считается только один, вносимый в лунки, компо­нент, поэтому такая иммунодиффузия и получила название простой, а не двойной. При соответствии антигенов и антител по специфичности в си­лу равномерной диффузии по всем направлениям (отсюда название «ра­диальная диффузия») преципитат образуется в зоне, представляющей окружность вокруг лунки. При этом площадь занятой преципитатом ок­ружности, определяемая по формуле S = nd , пропорциональна количе­ству диффундирующего компонента. Измеряя диаметр образованных преципитатом окружностей вокруг каждой из лунок и соотнося получен­ные величины с построенным заранее по результатам специально прове­денного эксперимента графиком соотношения квадрата диаметра и из­вестных концентраций одного из компонентов реакции (калибровочным графиком), можно точно определить концентрацию его в анализируемом растворе. Следует помнить, что условия проведения опытных реакций и реакций, дающих данные для построения калибровочного графика, должны быть полностью идентичными. Только в этом случае получен­ные в опыте данные можно считать достоверными. Наиболее часто ис­пользуемыми температурами для проведения такой иммунодиффузии являются +4°С или +18-20°С, время учета результатов - 40-48 часов.

Определенными недостатками преципитации в гелях являются дли­тельность проведения реакций и нечеткость результатов при невысоких концентрациях антигенов. С целью преодолеть эти недостатки во второй половине ХХ века были разработаны методы, сочетающие белковый электрофорез и иммунопреципитацию, которые получили общее назва­ние иммуноэлектрофорез (ил. 49). Помимо выигрыша во времени и по­вышения разрешающей способности такие методы дают возможность более четко отличить белковые антигены, имеющие одинаковые анти­генные детерминанты, но отличающиеся по молекулярной массе. Для этого достаточно так называемого обычного иммуноэлектрофореза. Для его постановки изготавливают гель, в котором помимо обычных старто­вых лунок готовят также желобок для сыворотки. Желобок располагают между дорожками в направлении от электрода к электроду, т. е. вдоль фронта движения белков. Гель из желобка не удаляют, чтобы не нару­шать прохождение электрического тока во время фореза. Сначала в соот­ветствующем буферном растворе проводят электрофорез образцов, ана­лизируемых на присутствие искомого антигена. После снятия электриче­ского поля пластинку геля переносят во влажную камеру, из желобка удаляют гель и вместо него вносят сыворотку или суспензию монокло- нальных антител. Результаты учитывают после инкубирования геля во влажной камере в течение 12-24 часов. В случае соответствия антигенов и антител в зоне между желобком и дорожками образуются преципитаты в виде дуг, вогнутой стороной направленных в сторону места располо­жения антигена. Для лучшей визуализации гель прокрашивают красите­лем, связывающимся с белком. Фактически такой метод является вари­антом двойной иммунодиффузии, но имеет большую разрешающую спо­собность и дает существенный выигрыш во времени.

Для некоторых белковых антигенов возможно применить вариант иммуноэлектрофореза, еще в несколько раз ускоряющий процесс. Это так называемый встречный электофорез (электросинерез). Метод основан на том, что различающиеся по аминокислотному составу белки в щелочной среде могут приобретать противоположные заряды и мигрировать при электорофорезе навстречу друг другу. Для проведения такого фореза используют буфер с рН 8,0, а в геле готовят лунки у противоположных концов (у катода и анода соответственно). В одну из лунок вносят антитела, в другую - содержащий антиген раствор. Под действием электрического поля компоненты двигаются гораздо быстрее, чем при обычной диффузии, поэтому преципитаты в центральной части геля будут образовываться в течение 1-3часов. К тому же чувствительность электросинереза приблизительно в 10 раз выше, чем у метода Оухтерлони, т. е. можно обнаруживать антигены, присутствующие в небольших концентрациях. Недостаток метода в том, что он не может быть применим к любым антигенам.

Описанные выше варианты иммуноэлектрофореза позволяют выявить антиген, но не определить его количество. Количественным методом (фактически модификацией иммунодиффузии по Манчини) является так называемый ракетный иммуноэлектрофорез. Для его постановки в охлажденный до 50°С гелеобразующий раствор вносят подогретую до такой же температуры сыворотку с таким расчетом, чтобы она составляла 1-5 % геля, перемешивают и готовят пластинку геля. После внесения в лунки антигенов проводят электрофорез, условия которого подбирают так, чтобы максимально ограничить смещение молекул антител в электрическом поле (чаще всего используют барбиталовый буфер с рН 8,6 и низкое напряжение). Время электрофореза должно обеспечить выход всех молекул антигена из лунки в гель и вхождение их в состав преципитата, обычно это происходит в течение двух часов. Преципитаты в таких условиях образуются в зонах по ходу движения антигена, которые имеют форму вытянутого конуса (ракеты). Длина зоны образования преципитата пропорциональна концентрации антигена, что дает возможность, измерив длину «ракеты» и используя специально построенный калибровочный график, определить количество антигена в пробе.

Вариантом ракетного иммуноэлектрофореза является так называемый перекрестный электрофорез. Для его постановки готовят обычной гель и проводят обычный электрофорез анализируемой пробы. При этом ис­пользуют одну пробу и лунку располагают у одного из краев пластинки. После проведения электрофореза часть пластинки (около 4/5 от исходно­го размера) отрезают и удаляют, оставляя только ту часть, в которой на­ходится дорожка первого электрофореза. Затем в ту же камеру заливают гелеобразующий раствор с сывороткой так, чтобы оставшийся участок пластинки объединился с новым, содержащим сыворотку, гелем. Меня­ют положение пластинки (или электродов) так, чтобы направление дви­жения антигенов было перпендикулярным тому, которое было при пер­вом форезе, и проводят второй форез в условиях, как для ракетного. Учет результатов проводят, как описано выше. В таком варианте результаты могут оказаться более точными, в силу того, что при втором форезе ана­лизируемыми образцами, фактически, оказываются чистые однородные белки.

Описанные выше реакции агглютинации и преципитации были введены в практику еще в конце XIX века и не утратили своего значения до сих пор, но уже в первые годы их применения стало понятно, что их разрешающая способность не всегда удовлетворяет исследователей. В частности, при малых концентрациях того или иного реагента образующиеся комплексы настолько невелики по размерам, что даже с применением микроскопии не могут быть фиксированы исследователем. Поэтому постоянно проводились попытки подобрать условия для более выраженной визуализации результатов взаимодействия антиген- антитело. Одной из успешных попыток стало применение эритроцитов крови в качестве носителей антигена.

БИЛЕТ 17