10. Покоящиеся формы бактерий. Споры и самообразования, прорастание спор. Свойства спор. Методы выявления, значения спор грибов и бактерий.

Покоящиеся (некультивируемые) формы бактерий

Специализированные анабиотические формы (такие как эндо- и экзоспоры, миксоспоры, цисты) известны лишь для ограниченного круга микроорганизмов. Однако как у спорообразующих микроорганизмов (Bacillus cereus) на фоне подавления спорообразования, так и у споронеобразующих (Pseudomonas carboxidoflava, Micrococcus luteus, Escherichia coli) бактерий внеклеточные микробные метаболиты, проявляющие свойства индукторов анабиоза, вызывают образование цистоподобных рефрактерных клеток (термин связан с переходом целой клетки в покоящуюся форму и увеличенной способностью данных клеток по сравнению с обычными сильно преломлять свет). В этих клетках снижение метаболической активности (гипометаболизм) сопровождается развитием резистентности к экстремальным воздействиям. Эти формы отличаются нерегистрируемым уровнем эндогенного дыхания, повышенной терморезистентностью и специфической ультраструктурой. По сравнению с вегетативными клетками, цистоподобные рефрактерные клетки обладают рядом особенностей ультраструктурной организации: у них снижена плотность рибосом в цитоплазме, цитоплазма приобретает мелкозернистую структуру, увеличена толщина клеточной стенки, в самой клеточной стенке появляются слоистость и некоторые плотные включения. Для споронеобразующих микроорганизмов цистоподобные рефрактерные клетки — единственная покоящаяся форма, способная сохраняться в течение нескольких лет, а для спорообразующих бактерий — альтернатива спорообразования. Поскольку рефрактерные клетки невозможно выявить с помощью традиционных бактериологических подходов, то в самое ближайшее время они могут создать серьёзную проблему при оценке их эпидемиологической и экологической значимости.

Споры бактерий

Прокариотические организмы бактерии обладают способностью к спорообразованию, которая заключается в том, что при наступлении условий, неблагоприятных для жизни, клетка частично теряет воду, объём и форму; под внешней мембраной образуется плотная сферическая оболочка.

В виде споры бактерия может выдерживать огромные механические, температурные и химические нагрузки. Например, некоторые споры выдерживают трёхчасовое кипячение или температуру жидкого азота. Также в виде споры более эффективно проходит расселение, потому что частично обезвоженная клетка имеет меньшую массу. Споры неустойчивы к ультрафиолету, как и вообще бактерии, и быстро погибают под таким излучением. Поэтому меньше всего бактерий — в высокогорной местности, а некоторые методы лечения инфекционных заболеваний, вызванных бактериальным возбудителем, предусматривают облучение пациента. Следует помнить, что споры у бактерий, в отличие от растений и грибов, служат не для размножения.

Споры бактерий окрашивают по методу Пешкова или по методу Марцелли.

Спорообразование у бактерий наблюдается в неблагоприятных условиях существования: при недостатке питания, высыхании среды, накоплении в ней вредных продуктов обмена, недостатке воздуха, резких колебаниях температуры и др. Сущность спорообразования заключается в уменьшении интенсивности процессов обмена у микробов и снижении их активности.

В процессе спорообразования цитоплазма теряет влагу, сгущается, собирается в определенном участие тела бактерии, облачается плотной непроницаемой для растворов оболочкой, в результате чего содержимое клетки принимает вид округлого или овального образования, которое называется спорой. В зависимости от размеров и расположения споры внешний вид микробной клетки либо не изменяется, либо принимает другую форму. Если спора образуется в центре клетки, то последняя принимает форму бочонка, лимона, веретена.

У столбнячной палочки спора образуется на конце, и поэтому клетка приобретает форму барабанной палочки. Споровые бактерии отличаются от вегетативных форм большой устойчивостью, легко переносят высушива-ние, замораживание, кратковременное или длительное кипячение, воздействие различных химических веществ. К спорообразующим бактериям относятся: возбудители сибирской язвы, столбняка, ботулизма, а также некоторые сапрофитные обитатели почвы. Спорообразующие патогенные бактерии часто встречаются в унавоженной почве. Они могут попадать в рану с землей.

Прорастание споры в оптимальных условиях осуществляется в течение 2-3 ч; процент проросших спор увеличивается после соответствующей предварительной обработки. Например, споры могут быть активированы кратковременным прогреванием.

• Прорастанию предшествует активация споры. Её инициируют различные химические вещества, повышение температуры и влажности. Под воздействием автолизинов происходит расщепление кортекса, поглощение воды и набухание. Внешне процесс проявляется увеличением («вздутием») споры и уменьшением коэффициента светопреломления. При этом в споре происходят глубокие физиологические изменения: усиливается дыхание, увеличивается активность ферментов, происходит выделение аминокислот, дипиколиновой кислоты и пептидов (потеря сухой массы споры может достигать 20-30%). В тот период спора утрачивает терморезистентность. Затем спора лопается в произвольном месте и из неё выходит вегетативная клетка, снабжённая у подвижных видов жгутиковым аппаратом.

Выявление спор бактерий

Окрашивание спор удается только в мазках.

Метод Вайсера—Хьюппе

1. Мазки окрашивают в растворе карболового фуксина или фуксина на анилиновой воде в термостате при 37 °С в закрытой посуде в течение нескольких часов.

2. Обесцвечивают 2,5 % раствором серной кислоты в течение 3 — 5 с и споласкивают 96 % спиртом, пока не перестанут отходить облачка красителя.

3. Докрашивают метиленовым синим 3 — 5 мин.

4. Ополаскивают в проточной воде, сушат на воздухе и изучают при масляной иммерсии.

Можно окрашивать карболовым фуксином, подогревая на огне мазок с красителем до появления паров 5 — 8 мин, но тогда дифференцировать следует 2,5 % серной кислотой в течение 10-20 сек.

Результат: споры окрашиваются в красный цвет, бактерии - в синий.

Метод Меллера

1. Фиксированные мазки помещают на 2 мин. в хлороформ.

2. Переносят в 5 % водный раствор хромовой кислоты на 2 — 10 мин.

3. Промывают в проточной воде и окрашивают карболовым фуксином 1 мин (стекло при этом подогревают на горелке до появления паров).

4. Дифференцируют в 5 % серной кислоте 5 с.

5. Хорошо промывают в проточной воде и подкрашивают водным раствором метиленового синего 3 мин.

6. Промывают в проточной воде, сушат и изучают при иммерсии.

Результат: опоры окрашиваются в красный цвет, бактерии — в синий.

Окраска малахитовым зеленым Шеффера-Фултона

1. Мазки, фиксированные над огнем, окрашивают 5 % водным раствором малахитового зеленого 5—10 мин.

2. Промывают в проточной воде.

3. Докрашивают 1 % водным раствором сафранина 30 с.

4. Промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.

Результат: споры окрашиваются в зеленый цвет, бактерии — в красный.

Метод Ожешки

На нефиксированный мазок наливают 0,5 % раствор соляной кислоты и подогревают над огнем 1 — 2 мин. С препарата сливают кислоту, тщательно промывают проточной водой, высушивают и после высыхания фиксируют на пламени. Фиксированный препарат окрашивают по методу Циля — Нильсена.

Результат: тела бактерий окрашиваются в синий цвет, споры — в красный.

Метод Битгера

Нефиксированный мазок обрабатывают 10 % формалином 10 мин, промывают проточной водой и высушивают. Окрашивают 3 мин аммиачным метиленовым синим (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего + 3 мл 98 % раствора аммиака + 80 мл дистиллированной воды), нагревая стекло над огнем до закипания красителя. Промывают проточной водой, докрашивают 0,5 % раствором сафранина 3—5 мин, промывают водой, высушивают и изучают при масляной иммерсии.

Результат: бактерии красные, споры синие.

Споры бактерий – это приспособление к выживанию в неблагоприятных условиях.

Плодовые тела несут споры, которыми грибы размножаются.

Споры бактериальные овальные или округлые образования, возникающие внутри палочковидных клеток — спороносных бактерий. Внутри каждой С. б. имеются компактное скопление дезоксирибонуклеиновой кислоты (См. Дезоксирибонуклеиновая кислота) (ДНК), Рибонуклеиновые кислоты (РНК) и белок. С. б. устойчивы к действию ядовитых веществ и др. отрицательных внешних факторов, что объясняется меньшим содержанием в них воды (15—20%), чем в вегетативных клетках, наличием 4—5 плотных труднопроницаемых оболочек и переходом ферментов в неактивное состояние. Устойчивость спор к высокой температуре (некоторые споры выдерживают кипячение в течение 30 и более мин) определяется присутствием в оболочках значительного количества кальциевой соли дипиколиновой кислоты. Попадая в свежую питательную среду, споры прорастают (полярно или экваториально), давая начало новым бактериальным клеткам.