23. Конъюгация. Значение f, Hfr, f1 факторов. Механизмы образования донорских клеток.

Конъюга́ция (от лат. conjugatio — соединение), парасексуальный процесс — однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид, бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Открыт в 1946 году Дж. Ледербергом и Э. Тайтемом. Имеет большое значение в природе, поскольку способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Из всех процессов горизонтального переноса генов конъюгация позволяет передавать наибольшее количество генетической информации.

Механизм

Для успешного установления контакта двух клеток в клетке-доноре должна присутствовать конъюгативная (половая, трансмиссивная) плазмида. Первой из них была открыта F-плазмида: эписома (способная встраиваться в бактериальную хромосому), длиной около 100 тыс. пар оснований. Плазмида несёт гены, кодирующие ряд функций. Одна из них — образование половых пилей, отвечающих за приклепление к клетке-реципиенту.

Конъюгативные плазмиды также кодируют белки, противодействующие прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной. Поэтому клетки, уже содержащие трансмиссивные плазмиды, на несколько порядков реже выступают в роли реципиентов при конъюгации.

Плазмидой кодируется эндонуклеаза, разрезающая одну из нитей её ДНК в определённой точке (oriT). Затем разрезанная цепь раскручивается и 5'-концом переносится в клетку-реципиент. Выдвигалось предположение, что ДНК передаётся по каналам в половых пилях, но к настоящему времени показано, что перенос идёт через поры в клеточной стенке. В первом сегменте поступающей в клетку реципиента нити ДНК расположены антирестрикционные гены. Эти гены должны транскрибироваться в реципиенте сразу же после своего поступления туда, чтобы обеспечить накопление белков, блокирующих процесс разрушения ДНК рестриктазами. Наконец, переданная цепь замыкается в кольцо и на её основе восстанавливается двунитевая структура ДНК плазмиды. Весь процесс длится несколько минут.

Конъюгативная плазмида может встраиваться в хромосому путём гомологичной рекомбинации с участием IS-элементов. Конъюгация при этом идёт по тому же механизу, однако реципиенту передаётся не только плазмида, но и хромосомный материала донора. В этом случае процесс затягивается на часы, часто происходит разрыв передаваемой нити ДНК. Путём искусственного прекращения передачи ДНК в разное время и наблюдения за тем, какие гены были при этом переданы, была получена карта хромосомы кишечной палочки (E. coli) и показано её кольцевое строение.

При выщеплении из хромосомы плазмида может захватывать её фрагмент и переносить его с собой в другую клетку (аналогия с трансдукцией). Данный процесс носит название сексдукции.

Некоторые мелкие плазмиды, называемые мобилизуемыми, могут быть перенесены при конъюгации с помощью аппарата переноса «хелперной» трансмиссивной плазмиды. Для этого они должны содержать последовательности, аналогичные oriT конъюгативной плазмиды и распознаваемые её эндонуклеазами.

Конъюгация между видами с различным классификационным положением

Для успешной конъюгации бактериальные клетки не обязательно должны принадлежать к одному виду. Показана даже возможность передачи посредством конъюгации генов от бактерий эукариотам: растениям и грибам. Например, бактерии рода Agrobacterium (семейство Rhizobia) содержит Ti и Ri плазмиды, которые переносятся в клетки растений, внедряются в ядро и изменяют их метаболизм, в результате чего клетки начинают вырабатывать опины, которые Agrobacterium использует как источник углерода и энергии. В Ti и Ri плазмидах существуют две системы генов, кодирующих свой перенос. Это vir гены для переноса в растения и tra гены для переноса в другие бактерии.

Конъюгативный перенос у основного лабораторного штамма бацилл – Bacillus subtilis 168

В лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики РАН по руководством профессора А. А. Прозорова впервые было показано существование конъюгативного переноса плазмид и хромосомных генов у основного лабораторного штамма бацилл – Bacillus subtilis 168.

Hfr-штамы E. Coli. Из F +-культуры можно выделить штаммы, при скрещивании которых с F – - клетками рекомбинанты образуются гораздо чаще (частота рекомбинации > 10-2). Эти штаммы обозначаются символом Hfr. В них F-фактор в свободном состоянии отсутствует, он встроен в бактериальную хромосому. Когда клетки Hfr вступают в контакт с клетками F-, между ними образуется коньюгационный мостик, и интегрированный F-фактор инициирует репликацию бактериальной хромосомы по типу катящегося кольца с того сайта, в который он встроен. Эта репликация приводит к переносу бактериальной хромосомы в F – - клетку. При конъюгации клеток Hfr и F – часто происходит разрушение мостика, и происходит обрыв хромосомы Hfr. В результате в F–клетку целая Hfr-хромосома попадает довольно редко.

F’-штамы. F-фактор, интегрированный в геном клеток Hfr штамма, иногда может спонтанно «вырезаться» из хромосомы. Клетка при этом из Hfr превращается в F +. Неточное вырезание может привести к тому, что ставший автономным F-фактор захватывает смежный участок бактериальной хромосомы или теряет некоторый участок собственной ДНК. Кольцевой F-фактор, включающий в себя бактериальные гены, представляет собой самостоятельный репликон, называемый F’-элемента. F’-элементы обычно переносятся в F–клетки. При передаче F’-элемента F- -клеткам возникает так называемая Частичная диплоидность. Такая частичная диплоидность позволяет осуществлять комплементационный анализ различных мутантов и выявлять доминантность или рецессивность различных аллелей опреде­ленных генов. В частично диплоидной клетке рекомбинация может происходить между генами бактерии, входящими в состав F’-элемента, и генами гомологичного участка бактериальной хромосомы. Единичный кроссинговер приводит к включению F’-элемента в бактериальную хромосому и образованию клетки типа Hfr с дупликацией генов, содержащихся в F’-элементе. Двойной кроссинговер приводит к образованию клетки F’-типа, в которой произошел обмен маркерами между бактериальной хромосомой и F’-элемектом.