21. Рекомбинации – обмен генетической информацией. Механизмы рекомбинаций у прокариот. Трансформация. Открытие явления трансформации. Опыты м. Гриффитса. Механизмы.

Рекомбинация — процесс обмена генетическим материалом путем разрыва и соединения разных молекул. Рекомбинация происходит при репарации двунитевых разрывов в ДНК и для продолжения репликации в случае остановки репликационной вилки у эукариот, бактерий и архей. У вирусов возможна рекомбинация между молекулами РНК их геномов. У прокариот — конъюгация, трансформация и трансдукция, а у вирусов — совместная инфекция.

Конъюга́ция (от лат. conjugatio — соединение), парасексуальный процесс — однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид, бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Открыт в 1946 году Дж. Ледербергом и Э. Тайтемом. Имеет большое значение в природе, поскольку способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Из всех процессов горизонтального переноса генов конъюгация позволяет передавать наибольшее количество генетической информации.

Трансформация – направленный перенос и встраивание в генетический аппарат клетки небольшого фрагмента чужеродной ДНК. Она происходит без участия вирусов – бактериофагов. Наблюдается лишь у немногих бактерий. Посредством генетической рекомбинации часть трансформирующей молекулы ДНК может обмениваться с частью хромосомной ДНК донора. Трансформацию используют также в экспериментах для определения порядка генов, расстояний между ними в молекулах ДНК и построения генетических карт. Известно, что бактерия Pneumococcus pneumonie имеет несколько форм. Вирулентность ее определяется наличием мукополисахаридной капсулы на поверхности клетки, которая защищает бактерию от воздействия со стороны организма – хозяина. Капсула – слой полипептидов или полисахаридов, липидов или гетерополисахаридов и до 90% воды, расположенных поверх клеточной стенки и выполняющий функции осмотического барьера, защиты от высыхания и механических повреждений. В результате размножившиеся бактерии убивают зараженное животное. Бактерии этого штамма (S-штамм) образуют гладкие колонии. Авирулентные формы не имеют защитной капсулы и образуют шероховатые колонии (R-штамм). Микробиолог Ф. Гриффитс в 1928 году инъецировал мышам культуру живого пневмококка R-штамма вместе с S-штаммом, убитым высокой температурой равной 65 градусов Цельсия.

Спустя некоторое время ему удалось выделить из зараженных мышей живые пневмококки, обладающие капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка – способность образовывать капсулы – перешло к живой бактерии, то есть, произошла трансформация этих клеток. От этого превращения клеток и возник сам этот термин. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма – S перешла к клеткам штамма – R. В 1944 году О. Эвери, К. Мак – Леод и М. Мак-Карти показали, что такое же превращение типов пневмококков может происходить в пробирке in vitro. Эти исследователи установили существование особой субстанции – «трансформирующего принципа» – экстракта из клеток штамма – S, обогащенного ДНК. Как далее выяснилось, ДНК, выделенная из клеток S-штамма и добавления в культуру R-штамма , трансформировала часть клеток в S-форму. Клетки стойко передавали это свойство при дальнейшем размножении. Обработка трансформирующего фактора ДНК-азой – ферментом, разрушающим ДНК, блокировала трансформацию. Открытие этого явления было первым прямым доказательством того, что генетическим материалом является именно ДНК (а не белки, как предполагалось ранее).Известны два типа бактериальной трансформации: естественная, например у Bacillus subtilis, и индуцированная, которая связана с тем, что бактериальная клетка специально готовится к процессу переноса ДНК, то есть она приобретает компетентность к трансформации.Весь процесс можно разделить на несколько стадий. Контакт с поверхностью клетки. Проникновение ДНК в клетку. Соединение трансформирующей ДНК с соответствующим фрагментом хромосомы реципиента. Репликация включенной в хромосому новой информации.Трансформацию наблюдали у многих бактерий, в частности у представителей родов Bacillus, Rhizobium, Streptococcus.Компетентные клетки несут на поверхности новый антиген. Называемый фактором компетентности. При добавлении факторов компетентности в культуру бактериальных клеток изменяются клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана. Стенка становится более пористой. Дополнительные впячивания мембраны внутрь клеток обеспечивают приближение присоединенного к ней нуклеоида к клеточной поверхности, что облегчает взаимодействие между донорной и реципиентной ДНК.

Условиями, существенными для присоединения ДНК к компетентным клеткам, являются ее размеры (молекулярная масса не менее 3*10^5 и интактность двуцепочечной структуры). По этим причинам ДНК, разрушенная ДНК-азой, не обладает трансормирующей активностью. Увеличить компетентность можно обработкой некоторыми химическими агентами или воздействием сильным электрическим полем (электропорация). В ходе трансформации одна из двух цепей ДНК деградирует и в клетку проникает другая, которая спаривается с гомологичным цчастком ДНК в реципиентной клетке, с цепью, являющейся комплементарной ей. Затем в результатае двойного кроссинговера между однонитчатой донорной ДНК и двунитчатой ДНКреципиента происходит образование рекомбинантной хромосомы реципиента. При этом у участке ДНК, ограниченном сайтами кроссинговера, одна нить ДНК имеет реципиентный сегмент, а вторая – донорный. Такие районы ДНК с различающимися последовательностями нуклеотидов в двух нитях называют гетеродуплексами. Уже после первого раунда репликации ДНК образуются два типа клеток: исходные и трансформированные, которые несут ДНК донора. Первые стадии трансформации – присоединение ДНК к клеточной оболочке, ее поглощение и деградация одной цепи – осуществляются с равной эффективностью независимо от ее гомологии с ДНК реципиента.Однако, процесс рекомбинации специфичен в отношении гомологичной ДНК и с негомологичной происходит с очень низкой частотой. Минимальная длина цепочки ДНК, способной интегрироваться в реципиентную хромосому, составляет около 500 пар нуклеотидов. Обычно в рекомбинации участвуют фрагменты донорной ДНК длиной около 200 тысяч пар нуклеотидов, или около 1 /200 всей бактериальной хромосомы.Частота трансформации по хромосомным маркерам зависит от свойств данного препарата ДНК, ее концентрации, состояния клетки реципиента, вида бактерий. У пневмококков при селекции по одиночному маркеру частота трансформации составляет 10^ -2 – 10^ -3 на одну клетку реципиента. У гемофильных бактерий частота трансформации варьирует от 10^ -3 до 10^ -7.

Трансформация, хотя и с очень низкой частотой, может происходить даже между разными видами бактерий, что помогает установить степень родства между ними. ДНК, освобождающееся в окружающуюся среду при лизисе стареющих культур бактерий, в природных условиях обладает трансформирующей способностью. Это значит, что трансформация является одним из природных способов обмена генетическим материалом у бактерий.Очень редко бывает, что единичная бактериальная клетка приобретает в результате трансформации более чем одно новое свойство. Передача через ДНК большего числа признаков наблюдается лишь в том случае, если культура микроба-донора генетически близка к клеткам микроба-реципиетна.С помощью трансформирующей ДНК могут передаваться такие признаки, как капсулообразование, синтез необходимых клетке веществ, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам и другим лекарственным веществам. Трансформация используется также для генетического картирования у бактерий. Как уже отмечалось, при трансформации в хромосому реципиента встраивается сравнительно небольшой фрагмент ДНК. Если два гена находятся в хромосоме на значительном расстоянии друг от друга, они не могут локализоваться в одном и том же фрагменте, трансформирующий ДНК. Одновременная котрансформация двумя независимыми фрагментами, содержавшими эти гены, - событие крайне мало вероятное. Таким образом, частота котрансформации двух генетических маркеров служи показателем расстояния между ними.