2.3. Стадии апоптоза. Фаза экзекуции внеядерная.

Фаза экзекуции является активной фазой апоптоза, происходящей немедленно после того, как в клетке включается программа самоуничтожения. Она длится около часа и характеризуется яркими морфологическими проявлениями апоптоза (т.е. блеббингом мембраны, конденсацией хроматина и фрагментацией ДНК). Кульминацией является разрушение клетки и упаковка ее для фагоцитоза. Большинство исследований фазы экзекуции фокусировалось на выяснении ядерных изменений с идентификацией механизмов, ответственных за ядерную экзекуцию - таких как связь между выделением цитохрома С, активацией каспазы 9/3 и фрагментацией ДНК.

Изучение цитоплазматических или внеядерных явлений задерживалось. Однако в течение конца 90-х гг понимание соответствующих механизмов и биохимических процессов привело к значительному росту интереса по отношению к явлениям, происходящим вне ядра в процессе фазы экзекуции. Несмотря на возникший интерес к внеядерной фазе экзекуции, на первый взгляд разные исследования кажутся относительно разрозненными. Однако если разделить фазу экзекуции на три последовательные фазы, почти все данные, полученные по явлениям внеядерной фазы экзекуции могут быть описаны в относительно логичной схеме.

Первой стадией является высвобождение (release). При вхождении большинства клеток в фазу экзекуции, они высвобождают прикрепления внеклеточного матрикса (ЕСМ) и реорганизуют фокальную адгезию (FA), приобретая более округленную морфологию. Эти наружные изменения коррелируют с потерей стрессфибрилл (если таковые имеются) и реорганизацией актина в переферийные (кортикальные) связанные с мембраной кольцевые пучки. Разборка микротрубочек также происходит на этой стадии.

Вторая стадия - стадия блеббинга начинается с сокращения актинового кольца связанного с миозином II с последующим периодом продолжительного впячивания и выпячивания плазменной мембраны. Это продолжается до тех пор, пока клетка не входит в стадию конденсации.

Третия стадия конденсации характеризуется трансформацией клетки в маленькие апоптические тела или в одиночный сжатый шарик, коррелируя с растворением полимеризованного актина.

Фаза высвобождения.

Первая фаза в большинстве клеток претерпевающих апоптоз состоит в откреплении ЕСМ (внеклеточного матрикса) и округлении. Процесс наиболее драматично выражен в распластанных клетках, которые обладают четкими прикреплениями матрикса и наличием стрессфибрилл, таких как фибробласты, эпителиальные и эндотелиальные клетки. Процесс наименее ярко выражен в клетках со слабыми прикреплениями матрикса, таких как лимфоциты. Фаза высвобождения была частично понята в эндотелиальных клетках, где сильные периферийно-латеральные FA комплексы (фокальной адгезии) разбираются одновременно с реконструкцией фокальных контактов прямо под округлившейся клеткой. Одновременно, актин перестраивается в форме периферийного кольца в преддверии блеббинга.

Ингибирование полимеризации актина при помощи малых концентраций цитохалазина D поддерживает распластанное состояние при наличии стимулов к апоптозу, что заставляет предположить, что реорганизация актина является существенным моментом. Акойния (апоптоз, обусловленный откреплением матрикса) представляет прямое вхождение в стадию высвобождения. В акойнийных клетках передача сигнала при помощи FA киназы фокальной адгезии разрушена, что приводит к изменениям в различных цепях передачи ключевых сигналов.

Белки фокальной адгезии. Внутриклеточно белок FAK прикреплен, как и три других структурных FA протеина (альфа-актинин, талин и белок pBo-CAS), которые привязывают актин к фокальным точкам адгезии. Пансиллин, еще один структурный FA протеин, дефосфорилирован и диссоциируется от FA

Актиновые регуляторы. Hsp27 , который участвует в реорганизации актина, является важным фактором в перестройке актина при апоптозе эндотелиальных клеток. Гельзолин также вовлечен в этой фазе, как следует из исследований с гельзолин -/- клетками, демонстрирующими значительную задержку в наступлении блеббинга, хотя, в конце концов, он происходит.

Микротрубочки. Разборка микротрубочек (МТ) происходит на ранней стадии фазы экзекуции и может быть необходима для округления клеток. Помимо прерывания внутриклеточного транспорта, разборка МТ нарушает организацию клетки и высвобождает большое число регуляторных белков, которые в норме привязаны к МТ.

Эффекторы. На фазе высвобождения существенную роль играют каспазы, поскольку если каспазы заингибированы, то во многих клеточных типах морфологические изменения не начинаются (однако это может происходить преимущественно в системах, где сигнальная передача апоптозных стимулов требует наличия каспаз в верхней части цепи). Каспазы связывают FA белки, включая FAK и p130CAS. Однако клетки многих типов сокращаются и/или начинают блеббинг невзирая на ингибицию каспаз.

Калпаины (Calpains), которые связывают альфа-актинин, фодрин и талин (структурные протеины, связывающие актин и плазменную мембрану) также задействованы в фазе высвобождения.

Киназы. Сигнальные воздействия p38MAP-киназы активируют hsp27 и реорганизацию актина. В анойкии MEKK-1, верхний регулятор p38MAP-киназы активируется каспазами и в свою очередь может играть роль в активации каспазы-7. Эта потенциально положительная цепочка обратной связи может объяснить, почему вхождение в фазу экзекуции является повидимому необратмым. p21 киназа 2 (PAK2), активируется малыми GTPазами Pac и Cdc42 и про нее известно, что она реорганизует актиновый цитоскелет, она переводится в активную форму каспазами. В неумирающих клетках другой представитель этого семейства веществ, Pak1 PAC-p21-activated kinase) , вызывает разборку стресс-фибрилл и ретракцию за счет фосфорилирования короткой цепи миозиновой киназы (MLCK) и уменьшения активации миозина. Таким образом Pak1 может быть важным в разборке стресс- фибрилл и косвенно в реорганизации актина.