3.3. Белки-транслокаторы.

Белки-транслокаторы - белки, осуществляющие движение транспортных пузырьков по филаментам цитоскелета. К отличительной особенности белков этой группы относится свойство преобразовывать энергию АТР в механическое усилие, способное перемещать частицы вдоль микротрубочек или микротрубочки вдоль субстрата. Соответственно, транслокаторы являются механохимическими АТРазами, и их АТРазная активность стимулируется микротрубочками. В отличие от структурных МАР, транслокаторы ассоциированы с микротрубочками только в момент АТР-зависимого перемещения. Они находятся в основном в свободном состоянии в растворе или ассоциированы с мембранными органеллами и частицами. Однако в присутствии негидролизуемых аналогов АТР или в отсутствие свободных нуклеотидов транслокаторы образуют прочный комплекс с микротрубочками и на этом свойстве основаны первоначальные методы их биохимической очистки из экстрактов тканей.

Белки-транслокаторы делятся на две группы: кинезиноподобные белки и динеиноподобные белки. Их главным функциональным отличием является способность в тестах in vitro опосредовать движение частиц по микротрубочкам в противоположные стороны - от минус-конца к плюс-концу для кинезина и от плюс-конца к минус-концу для динеина. В клетке это соответствует движениям от центра и к центру или антероградно и ретроградно соответственно. Недавно был обнаружен еще один белок, относящийся к группе транслокаторов - динамин. Этот белок способен образовывать пучки микротрубочек в отсутствие свободного нуклеотида и индуцировать скольжение микротрубочек в пучке в присутствии GTP или, несколько хуже, в присутствии АТР. Полярность опосредуемого динамином движения пока не изучена.

3.3.1. Кинезиноподобные белки.

Первый транслокатор этого типа был выявлен в гигантском аксоне кальмара. Авторы обнаружили, что в присутствии негидролизуемого аналога АТР, АМР-PNP, в препарате микротрубочек из аксоплазмы появляется минорный белок с молекулярной массой около 120 кДа. При добавлении избытка АТР этот белок экстрагируется с микротрубочек, а в экстракте появляется так называемая транслокаторная активность - при добавлении экстракта к смеси микротрубочек и латекса частицы латекса начинают перемещаться по поверхности микротрубочек. Микротрубочки, в свою очередь, способны перемещаться по поверхности стекла с преадсорбированным на нем экстрактом, содержащим транслокатор.

А налогичный белок был вскоре обнаружен в других типах клеток. Кинезины из разных источников очень сходны между собой по иммунологическим свойствам и по структуре молекулы. Кинезин является гетеродимером, состоящим из двух тяжелых (110-130 кД) и двух легких (58-70 кД) цепей. Молекула кинезина имеет удлиненную форму с двумя глобулярными головками на одном конце и вееровидным расширением на другом Кинезин является АТФазой, активность которой сильно стимулируется микротрубочками. Сайты связывания АТФ и сайты связывания микротрубочек расположены на глобулярной головке тяжелой цепи.

Методами негативного контрастирования и кругового оттенения платиной было показано, что молекула кинезина имеет форму стержня диаметром 2 - 4 нм и длиной 80 - 100 нм с двумя глобулярными головками на одном конце и веерообразным расширением на другом. В середине стержня находится шарнирный участок, в котором молекула может изгибаться. С помощью декорирования антителами с последующей электронной микроскопией было показано, что легкие цепи локализованы в веерообразном утолщении. Связывание антител с глобулярными головками подавляет транслокаторную активность кинезина. На основании этих данных было сделано предположение, что глобулярные головки содержат участок связывания с микротрубочками. Такое предположение подтверждается также данными молекулярно - генетического анализа, которые показали, что делеция N-концевого участка тяжелой цепи приводила к потере способности к связыванию с микротрубочками. Более того, экспрессированный in vitro N- концевой фрагмент тяжелой цепи размером около 50 кДа обладал механохимической активностью. Этот фрагмент был назван моторным доменом кинезина.

Предполагается, что генерация движения с помощью кинезина аналогична механохимическому циклу в актомиозиновой системе. Кинезин в культивируемых клетках существует как в растворимом, так и в связанном с мембранами виде. Кинезин в клетках ассоциирован с митохондриями, окаймленными пузырьками, синоптическими везикулами, но не связан с аппаратом Гольджи и ядерной мембраной.

Помимо кинезина существует целое семейство кинезиноподобных белков. Их общим свойством является наличие домена размером около 50 кДа, имеющего высокий процент гомологии с моторным доменом кинезина. Вне моторного домена последовательности кинезиноподобных белков уникальны и не имеют гомологии с другими известными транслокаторами. Кроме того, моторный домен может располагаться у кинезиноподобных белков как на N-конце, так и на С-конце.

Несмотря на многочисленные свидетельства транслокаторной активности кинезина in vitro, его функции in vivo до последнего времени не были прямо подтверждены. Первое экспериментальное свидетельство о функциях кинезина в клетках как антероградного транслокатора было получено в работе В.И.Родионова с соавторами в 1991 г. Авторы данной работы получили поликлональные антитела к моторному домену\Кинезин тяжелой цепи молекулы кинезина. Эти антитела ингибировали функции кинезина in vitro и узнавали кинезин из самых различных объектов. Оказалось, что при микроинъекции антител к кинезину в меланофоры рыб происходит полное подавление транспорта пигментных гранул к периферии клетки без нарушения их транспорта к центру. Почти одновременно другая группа авторов получила сходные данные для мышиных макрофагов. При введении в эти клетки антител к кинезину, обладающих аналогичными свойствами, наблюдалось нарушение

способности тубулярных лизосом вытягиваться вдоль микротрубочек.