3.3. Среда.

Параллельно с созданием культур разрабатывались среды, в которых эти культуры будут содержаться. Среда должна обладать следующими характеристиками: иметь большую буферную емкость (чтобы скомпенсировать изменения pH), содержать все необходимые для жизнедеятельности клетки вещества (аминокислоты, микроэлементы и т.п.).

Источником гормонов и факторов роста является сыворотка, добавляемая в среду. Кроме того, сыворотка вносит в среду фибронектин (прикрепляет клетки к субстрату), альбумин, трансферрин (связывает ионы железа и доставляет их к клеткам), минеральные вещества. Сыворотка может быть человеческой, крупного рогатого скота (КРС), лошадиной, северного оленя. В зависимости от того, на какой стадии онтогенеза взяли кровь, сыворотка бывает: эмбриональной, новорожденного, взрослого.

Одной из наиболее распространенной сред является среда №199. Эта среда насыщенная, поэтому возможно ее использование с другими средами. Среда №199 содержит почти все аминокислоты и витамины, предшественники нуклеиновых кислот, факторы роста, липиды. Те элементы, которых нет в среде, восполняются добавлением 5-10% сыворотки.

3.4. Виды культур.

• Культура СПЭВ. СПЭВ - культура эмбриональной почки свиньи. Клетки культуры СПЭВ являются трансформированными. Имеют эпителиоподобную морфологию. Характеризуются потерей контактного торможения: способны в культуре образовывать много слоев. Буква «В» в аббревиатуре появилась, так как ткань обрабатывали версеном.

• Культура CHO.

• Культура 3Т3 - культура фибробластов мыши.

• Культура FAF28 – фибробласты китайского хомячка.

IV. Метод радиоавтографии.

Радиоавтография является одним из способов обнаружения «меченых» атомов – радиоактивных изотопов. Принцип ее заключается в том, что, заменяя один из атомов изучаемого вещества соответствующим радионуклидом, тем самым метят данное вещество. Радиоавтография позволяет решать следующие задачи: 1) локальный синтез меченого вещества (ДНК, РНК, полисахариды); 2) динамика синтеза (по числу зерен); 3) транспорт веществ; 4) изучение дифференцировки клеток; 5) определение митотического цикла; 6) отслеживание трансплантированных клеток.

4.1. Общие принципы метода.

1. Введение предшественника исследуемого макромолекулярного соединения, один из атомов которого заменен на радиоактивный изотоп. Так, например, у тимидина водород в 5 или 6 положении заменяют на тритий - образуется ³Н-тимидин (см. далее). При работе с культурами клеток радионуклиды вводят в питательную среду. В экспериментах на животных метку чаще всего вводят в кровь, хотя более эффективным может оказаться и местное введение.

2. В процессе жизнедеятельности клетки такое меченое соединение будет включаться в биополимер. Так ³Н-тимидин будет включаться в ДНК при ее синтезе. На этот процесс необходимо время (определенное для каждого типа клеток).

3. По истечении этого времени препарат фиксируют. Фиксатор не должен быть сильным окислителем. Кроме того, препарат обязательно необходимо обработать трихлоруксусной кислотой (ТХУ) для удаления немеченых предшественников нуклеотидов: ТХУ проводит легкий гидролиз нуклеотидов.

4. Далее, если проводится исследование ткани, то кусочки ткани обезвоживают и заливают по стандартным методикам. Из полученных форм готовят срезы и приклеивают их на стекла.

Если проводится радиоавтографическое исследование культуры клеток, то покровные стекла с выращенными на них клетками после фиксации 2-3 часа промывают в проточной воде, ополаскивают дистиллированной водой, а затем 70% спиртом. Высушивают и оставляют в таком виде на ночь.

5. Следующий этап - покрытие фотоэмульсией. В это время в образце (ткань или культура клеток) идет распад изотопа: β-частицы летят в разных направлениях и попадают в зону фотослоя, активируя в нем зерна бромистого серебра. Покрытые фотоэмульсией препараты хранят в течение определенного срока (зависит от типа ткани) в темном месте.

5. Проявление препарата, в результате которого происходит восстановление серебра.

6. Фиксация для удаления галоидного серебра и атомов брома.