3.4. Метод негативного контрастирования.

Присоединение атомов тяжелых металлов к структурным компонентам объекта называется позитивным окрашиванием, так как при этом красится сам объект. Однако если биологический объект погружен в электроноплотное вещество, которое не окрашивает его, а создает вокруг него темный фон, то говорят о негативном окрашивании, или негативном контрастировании. Плотное вещество может также проникать в промежутки между структурными компонентами объекта или ложиться на его наружную поверхность, способствуя таким образом, контрастному выявлению деталей его поверхности. Этот метод был разработан Бреннером и Хорне в 1959г.

Особо широкое распространение для окрашивания по методу негативного контрастирования получил фосфорновольфрамовый натрий. Суспензия исследуемого материала готовится обычно в 1%-ном растворе фосфорновольфрамового натрия, затем суспензия из пульверизатора, либо с помощью микропипетки наносится на поверхность сетки, покрытой коллодием или формваром. Сетки высыхают почти мгновенно, и образуется тонкая пленка красителя, заключающая в себе объект.

Разрешение при негативном окрашивании выше, чем разрешение, получаемое на ультратонких срезах. Предел его составляет около 12 Å и определяется размером частиц высушенного красителя.

III. Метод культуры клеток.

3.1. История метода.

Культура клеток - метод длительного сохранения в живом состоянии клеток, тканей. Первые успешные опыты по культуре ткани осуществил в 1907 американский учёный Р. Гаррисон, поместив в каплю лимфы кусочек зачатка нервной системы зародыша лягушки. Клетки зачатка оставались живыми несколько недель, из них вырастали нервные волокна. Первая культура фибробластов была получена в 1943г. – это L-клетки. Из карциномы шейки матки в 1953г. была получена культура Hela.

3.2. Культивирование клеток.

Клетки можно культивировать как в стеклянной посуде, так и в пластиковой; но одно из главных условий ведения культуры – стерильность. Клетки прикрепляются к стеклу сосудов (стационарные однослойные культуры) или остаются во взвешенном состоянии во вращающихся сосудах (суспензионные культуры). Флаконы, используемые для культивирования клеток, на «лабораторном» языке называют «матрасами».

Пассирование – процесс пересадки клеток. Необходимо, так как:1) в старом флаконе заканчивается питательная среда; 2) количество клеток значительно увеличивается. Для пассирования необходимо клетки разделить друг от друга и от подложки. Для этого используют:

1) хелаты – вещества, удаляющие кальций: ЭДТА – 0,2% его раствор называется версеном;

2) ферменты: 0,25% раствор трипсина («откусывает» белки).

Первичная культура – культура клеток, полученная непосредственно из ткани или органа организма; как правило, такие культуры сохраняются ограниченное число пассажей. Перевиваемые (стабильные) линии полностью адаптированы к существованию вне организма; их получают из нормальных или раковых тканей; размножаются неограниченно долгое время. Появление постоянной линии клеток констатируется по следующим морфологическим изменениям: уменьшение размера клеток, снижение адгезивности клеток, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения, а также по: увеличению скорости роста, уменьшению зависимости от сыворотки и от субстрата, увеличению анеуплоидности.

Методика «съема клеток»:

1. Из «матраса» с клетками сливается старая среда.

2. В «матрас» наливается смесь версен:трипсин=3:1 (2мл). Это смесью производится только споласкивание (чтобы удалить остатки сыворотки).

3. Предыдущая смесь сливается и наливается смесь версен:трипсин=3:1 (5мл). «Матрас» ставится в термостат +37°С. время нахождения в термостате зависит от вида культуры.

4. По истечении необходимого времени смесь сливается и в «матрас» наливается 2-3 мл среды, «матрас» встряхивается.

5. Из «матраса» берется проба: в камере Горяева подсчитывается концентрация клеток, находящихся во взвеси. После этого определяется, во сколько надо развести среду, чтобы получилось концентрация 200 000 клеток на 1 мл среды.

6. Клетки переносятся в новый «матрас», в который добавляется 5 мл среды.