2. Сканирующая электронная микроскопия (сэм).

Первый сканирующий электронный микроскоп был построен в 1938г. в Германии, но в пользование был впервые выпущен только в 1965г. При сканирующей электронной микроскопии поверхность образца сканируется тонким электронным лучом (зондом) по квадратному растру, и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку (ЭЛТ), покрытую люминифором с длительным послесвечением. Вторая ЭЛТ с малым послесвечением и высокой разрешающей способностью используется для получения фотографий с образца.

Любое явление, которое возникает в результате взаимодействия электронного луча и образца, может быть преобразовано электронным путем в видимое изображение. Первичные электроны, рассеянные поверхностью образца, вторичные электроны, «выбитые» из атомов этого образца, первичные адсорбированные электроны – все они несут информацию об исследуемом образце. Распределение элементов в образце может быть обнаружено при улавливании электронов, подвергшихся обратному рассеянию поверхностными слоями образца, поскольку элементы с большим атомным числом рассеивают больше электронов, чем элементы с меньшим атомным числом.

В сканирующем электронном микроскопе используется более низкое рабочее напряжение, чем в обычных просвечивающих электронных микроскопах. Как правило, такое напряжение равно 1-30 кВ.

Для исследования биологических образцов чаще всего используют излучающий способ сканирования. При этом образец испускает вторичные электроны с низкой энергией, излучаемые поверхностью образца. Используя такой способ сканирования, удается при оптимальных условиях добиться выявления деталей поверхности с разрешением 100Å. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая в сотни раз больше, чем у светового микроскопа, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности.

3. Методы электронной микроскопии.

3.1. Метод напыления.

Почти все биологические объекты обладают низкой электропроводностью. С целью исключения накапливания зарядов и получения достаточно контрастной картины на поверхность образца напыляют металл. Для напыления используют металлы, характеризующиеся низкой степенью окисления, и их сплавы (золото, медь, алюминий, платина).

Напыление производят в специальной вакуумной камере путем нагрева и испарения металла в вакууме или «выбивания» атомов металла в результате действия ионов инертного газа. Металл, предназначенный для покрытия, закрепляют в специальном вольфрамовом испарителе. Под действием пропускаемого электрического тока в условиях вакуума испаритель нагревается до красного цвета, а помещенный в его воронку металл начинает плавиться. Атомы испаряющегося металла покрывают тонкой пленкой поверхность образца. Для того, чтобы пленка равномерно покрывала все неровности поверхности, столик с объектом вращается. Для исключения перегрева образца в момент напыления используют различные экраны.

Если объект имеет сложную конфигурацию, и металл не поникает во все углубления, контрастирование производят путем напыления углерода. Благодаря способности к рассеиванию в вакууме атомы углерода тончайшей пленкой равномерно покрывают все неровности. Ровный слой углеродного покрытия укрепляет поверхность объекта, защищает ее от атмосферной влаги и является удобной подложкой для покрытия металлом. Кроме того, углерод легко испаряется и настолько инертен, что ткань можно удалить, растворив ее. Напыленный на ткань металл называется репликой.

Недостатки метода: при обработке материала с неровной и пористой поверхностью не всегда удается получить равномерное покрытие; слой металлического покрытия может сгладить нежные морфологические образования; при длительном напылении происходит перегрев объекта, и поверхность его деформируется.