- •Занятие №2. Методы клеточной биологии.
- •II. Электронная микроскопия.
- •Э лектронная микроскопия.
- •1. Трансмиссионная электронная микроскопия (тэм).
- •Основы конструкции электронного микроскопа. Принцип работы электронного микроскопа.
- •Подготовка материала к исследованию в трансмиссионной электронной микроскопии.
- •Взятие материала для фиксации.
- •2. Фиксация.
- •3. Постфиксация.
- •4. Дегидратация (обезвоживание).
- •5. Позитивное контрастирование.
- •6. Пропитывание ткани заливочной смесью.
- •7. Заливка материала.
- •8. Работа на ультратоме.
- •9. Окрашивание ультратонких срезов.
- •2. Сканирующая электронная микроскопия (сэм).
- •3. Методы электронной микроскопии.
- •3.1. Метод напыления.
- •3.2. Метод оттенения металлами.
- •3.3. Метод замораживания-скалывания (замораживании-травления).
- •3.4. Метод негативного контрастирования.
- •III. Метод культуры клеток.
- •3.1. История метода.
- •3.2. Культивирование клеток.
- •3.3. Среда.
- •3.4. Виды культур.
- •IV. Метод радиоавтографии.
- •4.1. Общие принципы метода.
- •7. Промывание проточной водой. Окрашивание препаратов.
- •4.2. Изотопы, применяемые в радиоавтографии. Их свойства.
- •4.3. Фотографическая эмульсия.
- •4.4. Механизм получения скрытого изображения.
- •4.5. Получение радиоавтографа.
- •4.6. Разрешающая способность метода.
- •4.7. Метод электронно-микроскопической радиоавтографии.
4.6. Разрешающая способность метода.
Разрешающая способность – одна из существенных характеристик метода радиоавтографии. Как было уже описано выше, изображение на автографе создается за счет испускания β-частиц и состоит из зерен серебра, распределяющихся с разной плотностью вокруг источника излучения. Если длина пробега β-частиц не слишком велика, Как например, при использовании трития, то практически все наблюдаемые зерна серебра будут соответствовать трекам β-частиц. Треки β-частиц криволинейны. Поэтому на радиоавтографах наблюдаются не отдельные треки, а зерна серебра, расположенные вокруг изучаемого источника с разной плотностью.
Максимальная плотность зерен наблюдается непосредственно над источником излучения и постепенно уменьшается по мере удаления от него. В конце концов плотность зерен снижается до уровня фона, однако точно установить этот момент практически не возможно. Поэтому разрешение обычно определяется как расстояние, на котором плотность зерен серебра уменьшается в 2 раза по сравнению с максимальной плотностью зерен непосредственно над источником излучения. Соответственно, разрешающая способность тем выше, чем меньше указанное состояние.
На разрешающую способность влияют:
1) энергия испускаемых β-частиц (то есть природа изотопа);
2) расстояние между источником излучения и слоем эмульсии;
3) толщина источника излучения;
4) толщина эмульсионного слоя;
5) величина зерна фотоэмульсии;
6) время экспозиции препаратов с фотоэмульсией.
4.7. Метод электронно-микроскопической радиоавтографии.
Этот метод является модификацией метода радиоавтографии, направлен на получение максимального разрешения, которое бы позволило подвергнуть радиоавтографическому анализу структуры, наблюдаемые в электронном микроскопе. Если наивысшее разрешение светомикроскопической радиоавтографии при использовании трития составляет 1 мкм, то разрешение электронно-микроскопической может достигать 0,1-0,2 мкм. Второе преимущество этого метода – возможность получить радиоавтограф над срезом, представляющим более детальную картину клетки.
Методы радиоавтографии, применяемые в электронной микроскопии, более сложны и требуют значительно больше времени, чем методы радиоавтографии для световой микроскопии. Единственный изотопом, который широко используется в электронной микроскопии, служит тритий; в некоторый случаях используют изотоп серы. Ткань для метода электронно-микроскопической радиоавтографии также фиксируют в глутаральдегиде, формальдегиде или четырехокиси осмия. У каждого фиксатора есть свои недостатки. Четырехокись осмия может ускорить исчезновение скрытого изображения. Формальдегид и глутаральдегид могут снизить чувствительность фотоэмульсии.