4. Ак. Технол. Схема производства лизина.

Производят в 1 стадию МБ синтезом или в 2 стадии из D,L- -аминокопролактана.

В нашей стране производство лизина (кормовой препарат) разработано по одностадийному МБ синтезу в институте биохимии им Баха АН СССР совместно с институтом МБ им Кирхеншейна Латвийской СССР в 70-х годах 20-ого века.

1970 – запущен леванский опытный завод по производству ЖКЛ и ККЛ.

Продуценты: глутамат-продуцируемые бактерии рода Corynebacterium и Brevibacterium.

На ливанском опытном заводе использовали:

- Br.sp-22 ауксотроф по гомосерину, биотину, тионину. Продуктивность 25-38 г лизина/лКЖ.

Br.sp-22Л может синтезировать до 40 г лизина/л КЖ

Br.sp-22ЛД может синтезировать до 40 г лизина/л КЖ

Регуляция:

- Высшие растения и бактерии синтезируют лизин через α-диаминопемелиновую кислоту. Синтез начинается с аспарагиновой кислоты и проходит через диаминопимелиновую кислоту. Помимо L- лизина, аспарагиновая кислота является также предшественником для L-метионина, L-треонина и L-изолейцина.

Аспаргиновая к-та в β-аспартилфосфат и под д-ем аспартаткиназы в β-аспартатполуальдегид из которого обр-ся L-лизин и гомосерин (под д-ем гомосериндегидрогеназы). Из гомосерина метианин и треонин.

Треонин – ингибитор аспартаткиназы. Он обр-ся из гомосерина. Поэтому для синтеза лизина необходимы штаммы-ауксотрофы по гомосерину и треонину.

Метионин – репрессор к гомосериндегидрогеназе. Изолейцин – ингибитор треониндегидрогеназы.

- Биотин. При превышении концентрации 2-5 мкг биотина происходит накопление других метаболитов, а при лимитировании по биотину клеточные мембраны становятся проницаемыми для кислых АК

ПС: чаще всего на основе мелассы, кукурузного экстракта и ацетатные ПС.

*ПС на основе мелассы:

Основная ферментация

- меласса 7-15% по содержанию сахара

- кукурузный экстракт до 1.5%

- минеральные соли((NH₄)₂SO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, CaCO₃)-1-2%

- пеногасители 0,1% (животный или растительный жир)

- рН 7.0-7.2

Среда для посевного материала имеет такой же состав, за исключением мелассы (в 2 раза меньше)

*Ацетатная питательная среда

Она используется на стадии основной ферментации и на стадии приготовления посевного материала

- CH₃COONH₄ до 1,5%

- глюкоза 1%

- K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄ – 0,1 - 3%

- гиролизат соевой муки как источник аминокислот и витаминов- 1.5%

Помимо аммонийного азота в состав питательной среды можно использовать мочевину, т.к. штаммы обладают пуреазной активностью. Однако мочевина вводится дробно количеством <2% , иначе растет биомасса, но снижается синтез лизина.

- оптимальное соотношение углерода и азота от 10:1 до 11:1

Стерилизацию ПС проводят термическим методом. Причём термолобильные компоненты (меласса) стерилизуют отдельно в более мягких условиях. Мелассу нагревают до 80⁰С и выдерживают в течение часа, далее стерилизуют при 120-125⁰С 10-15 мин. Остальные компоненты стерилизуют в более жестких условиях 120-125⁰С 30-60 минут.

Питательную среду передают в ферментёр, охлаждают до температуры культивирования и вносят посевную дозу продуцента (до 10%).

Т.к. штамм продуцента ауксотроф по гомосерину, то необходимо вводить в состав питательной среды аминокислоты семейства аспарагиновых: метионин, трионин, изолейцин в соотношении 1:4:6. оптимальная концентрация трионина составляет 0.2-0.8 мг/мл. В качестве источника данных аминокислот используют

- кукурузный экстракт (содержание трионина 1.4% на СВ)

- гидролизат кормовых дрожжей 1,3 мг%

- гидролизат казеина 6,1 мг%

Приготовление посевного материала

Исходную культуру высевают в пробирки с 2% МПА. Далее смывают стерильной водой 8-10 мл на косяк и инокулируют в маточные колбы(750 мл с содержанием 100-150 мл питательной среды)

Состав питательной среды:

- меласса до 5%

- кукурузный экстракт до 3%

- NaCl - 0,4%

- рН 7,0-7,2

Условия выращивания: качалка 180-200 оборотов в минуту, 29-30⁰С, 24 часа.

Из маточной колбы проводят засев посевной колбы на среду аналогичного состава. Объем посевной дозы 3-5% от объема питательной среды. Выращивают 24 часа.

Из посевных колб проводят засев в инокулятор объема 250-500 л. Используется среда аналогичного состава.Количество передаваемого посевного материала – 0,1%

Условия культивирования: перемешивание (300 об/мин), аэрация (степень аэрации 0,8-1), К_З=0,5-0,6, 24 часа, Т = 29-30⁰С, рН = 7,0-7,2. Рост до титра 10⁹/мл. контроль проводят по оптической плотности.

В зависимости от мощности производства можно использовать и 2-ю ступень инакуляции.

Далее направляют на стадию основной ферментации (1-5% по объему)

Ферментацию проводят в стандартных ферментёрах объемом 60-63-100 м³ с механическим перемешиванием. Ферментёры сначала промывают и стерилизуют. Стерилизация острым паром 1 час под давлением 0,1МПа одновременно с трубопроводами.

Условия культивирования: К_З=0,6-0,75; степень аэрации =0,8-1; Т=28-32С; рН=7,0-7,5 (25% р-р NH₄OH). Первые 24 часа происходит рост биомассы, потребляется до 25% всех углеводов питательной среды, а также всех аминокислот. Далее уменьшение скорости роста биомассы и увеличение синтеза лизина. МАХ скорость синтеза 0,8-1 г /л в час.

Конец ферментации – уменьшение концентрации клеток, контроль по оптической плотности и по содержанию остаточного субстрата (сахарозы). Количество сахара не должно превышать 0,5-1%. Содержание лизина в культуральной жидкости до 40% . Экономический коэффициент 35%. Выход можно увеличить применяя дробную политику – выход до 50г/л.

При ацетатной питательной среде применяют только дробную политику ацетатом(1 моль/л уксусной кислоты и 0,25 моль/л ацетата аммония). Концентрация не должна превышать 2% иначе ингибируется фермент ЦТК. Экономический коэффициент 27%

На ацетате-34г/л за 72ч ферментации.

При оптимальных условиях до 50 г/л (в лаборатории)

Стадии выделения и очистки

Производство высокоочищенного кристаллического препарата.

Используют адсорбционные методы очистки:

- активированным углём

Ионно-обменные методы разделения:

- катиониты (КУ-2-8). Используются колонны d:h - от 1:7 до 1:10

рН раствора перед очисткой доводят до 1,6-2,0 с помощью серной кислоты (лизин переводят в заряженную частицу). Промывка катионита водой. Элюирование лизина 0,5-5% раствор аммиака. Эллюат выпаривают на вакуумной установке при 60⁰С до содержания СВ 30-60%. Далее подкисляют до рН 4,9 и направляют в кристаллизатор. Температура 12-14⁰С. Лизин отделяют на НУТЧ фильтрах под давление азота, и высушивают при 60⁰С на полочной сушилке.

Маточный раствор из кристаллизатора объединяют снова с эллюатом и выпаривают.

Если кристаллы окрашены, то с НУТЧ фильтра их отправляют в кристаллизатор, растворяют в 3-4 объемах деионизированной воды при 70% и очищают от пигментов. Упаривают. К концентрату добавляют 3-4-х кратный объем 96% этилового спирта. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают спиртом, высушивают при 60⁰С. Далее на регенерацию спиртаю Выход лизина 75%.

Основные потери – ионообмен. Готовый препарат содержит до 98% лизин-хлорида.

Регуляция:

- Высшие растения и бактерии синтезируют лизин через α-диаминопемелиновую кислоту. Синтез начинается с аспарагиновой кислоты и проходит через диаминопимелиновую кислоту. Помимо L- лизина, аспарагиновая кислота является также предшественником для L-метионина, L-треонина и L-изолейцина.

Аспаргиновая к-та в β-аспартилфосфат и под д-ем аспартаткиназы в β-аспартатполуальдегид из которого обр-ся L-лизин и гомосерин (под д-ем гомосериндегидрогеназы). Из гомосерина метианин и треонин.

Треонин – ингибитор аспартаткиназы. Он обр-ся из гомосерина. Поэтому для синтеза лизина необходимы штаммы-ауксотрофы по гомосерину и треонину.

Метионин – репрессор к гомосериндегидрогеназе. Изолейцин – ингибитор треониндегидрогеназы.

- Биотин. При превышении концентрации 2-5 мкг биотина происходит накопление других метаболитов, а при лимитировании по биотину клеточные мембраны становятся проницаемыми для кислых АК

1. Производство высокоочищенного кристаллического препарата.

Исп-ся адсорбционные методы очистки: очистка на акт. угле, ИО методы.

Для ИО исп-ют катиониты КУ-2-8 (NH⁴⁺), емкостью 8-10 г/100г СВ. Исп-ют колонны d/h=1/7-1/10 (мах высота -10м). рН р-ра перед очисткой доводят до 1,6-2,0 с помощью серной к-ты, чтобы протонизировать 2 аминогруппы. Промывку катиона проводят водой. Элюирование 0,5-5% р-ром NH3. Элюат упаривают на вакуум-выпарном аппарате при 60 °С до содержания сух. в-в 30-60%. Далее подкисляют НСl до рН=4,9 и направляют в кристаллизатор (при Т=12-14°С). Далее лизин отделяют на нутч-фильтрах, под давлением в атмосфере азота. Высушивание при 60 °С.

Маточный р-р из кристаллизатора объед-ют с элюатом, поступающим с колонн, и выпаривают. Если кристаллы получаются окрашенными, то с нутч-фильтра их отправляют в кристаллизатор, растворяют в 3-4 объемах воды при 70°С, очищают от пигментов на акт угле (анионит) или повторно на катионите.

Далее р-р упаривают и концентрируют, добавляя 3-4 кратный объем 96% этанола. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают спиртом и высушивают при 60 °С. Водно-спиртовые р-ры направляют на регенерацию спирта.

Выход лизина 75%. Готовый препарат сод-т до 98% хлор-лизина. Осн потери на стадии ИО очистки.

2. Производство ЖКЛ (жидкий концентрат лизина)

Культуральную жидкость (КЖ) стабилизируют 25-% раствором гидросульфата натрия (0,4% от V КЖ). После этого ее подкисляют НСl до 4,5-5 (уменьшение потерь на 5-15%).

Далее нагревают р-р до 100°С и направляют на вакуум-выпарную установку, упаривают в 3-4 раза до содержания сух.в-в 40% (исх=10-15%). В таком виде концентрат разливают в цистерны и используют для откорма животных. Срок хранения 3 месяца.

3. Технология ККЛ (кормовой концентрат лизина).

Его производят на основе ЖКЛ, высушиванием концентрата на распылительной сушилке до остаточной влажности 8-10%. Готовый препарат содержит 15-20% лизина, до 14% других АК, до 15% белка, примерно 25% зольных в-в.

Для повышения технологичности была предложена модифицированная схема. – в жидкий концентрат лизина добавляют наполнитель (костная мука, бентонид, пшеничные отруби) с таким расчетом, чтобы остаточная влажность составляла 70%, после чего полученную массу высушивают на вальцово-ленточной сушилке. Такой препарат содержит до 20% лизина.

4. Высокоочищенные кормовые препараты лизина.

КЖ без фильтрации и предварительной обработки сразу отправляют на катионит КУ-2-8. Предварительно подкисляют КЖ НСl до рН=1,6-2,0. Затем колонны промывают водой и элюируют лизин водным аммиаком. Элюат упаривают под вакуумом до сух.в-в 30-50% при Т=30-50°С. Подкисление НСl до рН=4,9, высушивают на распылительной сушилке. Выход лизина до 70%.

В институте МБ Кирхенштейна была разработана технология непрерывного культивирования производственного штамма Brevibacterium sp22Л. Культивирование проводят в хемостате, скорость потока 0,2 ч-1, содержание лизина в КЖ – 6,8 г/л, содержание биомассы 8 г/л (при периодическом культивировании 10-15 г/л)

5. МБ пр-во орг к-т. Техн. схема пр-ва лимонной к-ты глубинным способом.

МБ способом получают: уксусную, молочную, итоконовую, глюконовую, лимонную и некот др к-ты.

Продуцент: В РФ для пр-ва используется гриб Asp. niger.

Метаболич ист-к лимонной к-ты в организме служит ЦТК. Р-ция образования лим к-ты открывает цикл Кребса, в кот цитрат постепенно окисляется до щавелево-уксусной к-ты (оксалоацетат), кот вновь соед-ся с АсСоА и обр-ет цитрат. Т.е. мех-м ее образования основан на функционировании ЦТК в рез-те неполного окисления субстрата, а скорость синтеза субстрата зависит от поступления оксалоацетата.

Регуляция:

- Пониж конц Cu актив-ет фосфофруктокиназу, она акт-ет р-ции гликолитического пути и соотв ЦТК.

- Fe входит в состав аконитазы, которая изомеризует цитрат в изоцитрат, т.е. идет в ЦТК.

- Катализируется ферментом цитратсинтетазой, который ингибируют NADH, сукцинил СоА, ЖК-предшественники АсСоА (из-за аллостерических эффектов)

- Фторацетат превращаясь во фтороацетат становится ингибитором аконитазы, но ЯД

- Р-ция протекает с нормальной скоростью лишь при условии хорошей аэрации.

- Накопление в КЖ больших кол-в субстрата явл-ся невыгодным для организма и явл-ся следствием метаб дизбаланса, поэтому в норме клетка не будет произв-ть синтез лим к-ты (надо убрать P, Zn, Mn, Fe). При отсутствии этих в-в на субстрате происх сверхсинтез лим к-ты, но роль их не выяснена. Предположение: их отсутсвтвие влияет на морфологию гифов и проницаемость мембран.

- Кислая рН (3-4) ведет к облегчению стерелизации => не требуется особая стерильность, в то же время среда не позволяет образовываться побочным продуктам.

Подготовка посевного материала. В кач-ве посевного материала исп-ся суспензия конидий гриба (конц 10⁸ – 10⁹ спор/мл). Посевной материал получают пов способом в 2-3 этапа (пробирки, колбы, кюветы).

Основа ПС: пшеничные отруби.

Время культивирования в посевной кювете 72 часа (спорообразование)

1 способ: конидии гриба аспирационным образом смешивают с акт углем (1:3). В таком виде посевной материал сохраняет свою акт-ть в теч 2-3 недель.

2 сп: культуру продуцента из посевных кювет высушивают, измельчают и исп-ют как посевной материал.

Ферментация: Основу ПС для пр-ва лим к-ты сост-ет меласса. При пр-ве уделяется особое внимание ее кач-ву (проводится проверка на пригодность) при культивировании продуцента 1,25 кг к-ты/м² ПС в сутки (для пов культуры) или 10-12 кг/м³ в сутки (для глуб культуры). Если меласса удовлетворяет этим требованиям, то в пр-во мелассу предворительно разбавляют до конц сахарозы 13-15% (пов) и 3-4% (глуб). рН р-ра для удаления ионов тяж Ме р-ром желтой кровяной соли (в пр-ссе этой обраб освобожд-ся, в первую очередь, от ионов Fe и Mn).

1. Поверхностное культивирование

М.б. в виде: - бессменного культивирования

- односменное (через неделю р-р из кювет сливают, мицелий гриба промывают дист водой, заливают новую ПС)

- с доливом бессменный (первонач 30-35%, доливают 1 или неск раз через 4-5 суток с нач роста)

Применение 2 и 3 режимов позволяет увеличить выход к-ты примерно на 20%.

Разбавленный р-р мелассы подают в варочный котел, доводят до кипения и вводят конц р-р желтой кров соли (содержание FeCN не>10 мг%). В кипящий р-р добавляют KPO4, а также ZnSO4, KCl, MgSO4 (конц 0,01-0,05%), р-р подают в бродильное отделение (предворит охл до 45-50С), доп ПС не стерилизуют.

Пр-сс брожения проводят в кюветах из нержавеющей стали или Al. Толщина слоя ПС = 8-18 см; аэр 3-18м³ стерильного возд/м² кюветы, Т=30-32С, пр-сс идет в ростильных камерах.

В п-д кислотообр-я после 36 часов роста аэр МАХ. В конце культивирования начиная с 5 суток ее снижают до 3-4 м³ возд/м² кюветы. В это же время определяют титруемую кислотность КЖ и остаточное сод-е сахаров. Ср рН=3, конц сахаров не > 0,5%. КЖ сливают в сборник, мицелий промывают горячей водой, высушивают и добавдяют в кач-ве корм добавки.

Промывные воды объед с КЖ. В конце культив-я конц орг к-т в КЖ=12-20% (из них 94-98% - лим к-та)

2. Глубинное культивирование

1. Подготовка ПС. Для культивир-я исп-ют р-р мелассы 3-4% по сахару. В варочных котлах

2. Аэр в пр-ссе культивирования = 1. T=34-36С. Пеногаситель (до 0,1%): ЖК, растит масла. Время аэр= 36часов. После 24 часов роста добавляют 25-28% р-р мелассы.

3. По окончанию култивирования КЖ обраб-ют острым паром до 65С и сливают в сборник. Сод-е к-т 5-12% (лим 80-98%), остат сахар 0,5-1,5%. Помимо лим КЖ содержит щавелевую и глюконовую к-ты. Поэтому в пр-ссе выделения и очистки лим к-ты исп-ют метод последоват осаждения.

4. КЖ сначала направляют на стадию вакуум-фильтрации. Осадок мицелия обраб-ют горячей водой. Мицелий высушивают и исп-ют как кормовую добавку. Промывные воды объединяют с фильтратом КЖ

5. Осаждение орг к-т из фильтрата КЖ в виде солей Са.

Удаление щавелевой к-ты. К КЖ добавляют гашеную известь (рН р-ра не > 3). В осадок выпадает оксалат Са. Р-р фильтруют, нагревают до 80-90С и повторно обраб-ют известью (рН=6,8-7,4). В осадок выпадает цитрат Са, а глюконат Са ост-ся в р-ре. Осадок отфильтровывают на вакуумном НУЧ-фильтре и промывают водой (80-90С). Затем осадок цитрата Са суспендируют в небольшом кол-ве горячей воды (1:3). К суспензии добавляют расч кол-во 28% H2SO4 (ок 0,425 л/кг осадка). Р-р кипятят 10-20 минут, добавляют ВаSO4 (100 г/ 100 кг лим к-ты) для удаления тяж Ме. Затем р-р фильтруют, обраб-ют акт углем для обесцвечивания и упаривают при 80-90С до конц лим к-ты 70% и этот концентрат отправляют на кристаллизацию (8-10С) в кач-ве затравки добавл неск крист лим к-ты, через 30-45 мин кристаллы отфильтровывают, промывают хол водой и высушивают на ленточной или барабанной сушилке (35-40С)

Конечный продукт содержит 99,5% лимонной к-ты.