3. Иммобилизованные биокатализаторы (носители, способы иммобилизации)

Ферменты исп-ся в спиртовой, кожевенной, крахмало-паточной, мед и др. отраслях промышленности.

Инженерная энзимология — разработка БТ пр-ссов в кот исп-ются каталитическое д-е ферментов, выделенных из состава биол систем или находящихся в клетках, искусственно лишенных спос-ти роста.

В осн инж энзимологии лежит прим-е иммоб ферментов или ферм систем. В живых системах ферменты способны функц-ть достаточно длит время без существенных потерь акт-ти. В пром-ти при исп-ии ферм препаратов, ферменты часто инактивируются после одноразового исп-ия. С одной стороны, это объясн-ся тем, что в клетках ферменты нах-ся в иммоб (прикрепл к различным структурам) сост-ии и, кроме того, произв-ым циклом - д-е ферм и выдел-е прод-та, в ходе кот, фермент инакт-ся и часто явл-ся балластом.

Одним из способов реш этой проблемы явл-ся иммоб-ция фермента или ферм препарата, т.е. перевод его в нераств сост-е с сохранением (частичным или полным) каталитической акт-ти. Решается данная задача: закреплением фермента внутри или на пов-ти нераств носителя; внутримол или межмол сшивкой белковых мол-л низкомол бифункциональными агентами; присоед-ем к раств-ому полимеру; огранич-ем подвижности фермента с помощью мембран.

В общ виде иммоб фермент представляет систему: фермент (Ф); носитель (Н); связующий агент (С).

Иммоб ферменты - препараты ферментов, связанные на нераств носителях иили ограничение движения белковых мол-л или их фрагментов в пространстве внутри- и межмол-ыми сшивками низкомол-ыми бифункциональными агентами или их присоед-ем к растворимому полимеру.

Преимущества иммоб ферментов и ферментных препаратов как гетерогенных катализаторов:

- возм-ть отделения фермента от среды, сод-щей продукты катализируемой р-ции для его повторного исп-я и получения чистого, незагрязненного ферментом продукта;

- непрерывность и регуляция пр-сса;

- приводит к стабильности фермента как при опт условиях, так и отличных от них (технологичность), хотя иммоб часто снижает акт-ть фермента (до 70% для ковалентных методов иммобилизации);

- целенаправленное изм-е св-в ферментов по стабильности, рН, Т, скорости р-ции и специфичности (особенно для макромолекулярного субстрата).

Носители для иммобилизации:

Требования к носителям:

- доступность;

- гидрофильность;

- инертность;

- связь м/у носителем и ферментом не должна затрагивать акт центр фермента;

- носитель и фермент должны иметь разноименные заряды;

- уменьшение размера носителя увеличивает закреплённого на его пов-ти фермента;

- содержать реакционно-способные группы.

Носители м.б.

1 органические (полимерные и низкомолекулярные): наиб широко исп-ся

Органические низкомолекулярные носители.

*природные полисахаридные, белковые и липидные)

Пр: полисахариды: целлюлоза; декстран; агароза и их производные, сефадексы (сшитые эпихлоргидрином декстраны) и т.д.). Исп-ют также агар, альгинаты, гепарин (сульфатированные остатки D-глюкуроновой к-ты и сульфатированные остатки глюкозамина). Из прир носителей, прим-ых в медицине можно отметить и белки (коллаген и фибрин)

*синтетические (полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные)

Пр: носители на основе промышленных марок ИО смол, а именно полимеры на осн стирола и дивинилбензола (Дауэкс, Амберлит) - механич прочность, стабильность и нераств-ть.

Недостаток: гидрофобны, поэтому модифицируют (вводят ангидридные гр). Пр, сополимеризуют малеиновый ангидрид со стиролом, с доп поперечнй сшивкой углеродных цепей гексаметилендиамином.

Кроме того, исп-ют носители на осн полиакрилатов (ПААГ, цепи кот доп сшиты N,N-метилен-бис-акриламидом) — биогели, энзакрилы, акрилексы.

2 неорганические носители на основе:

- синтетических кремнезёмных сорбентов;

- металлы и их окислы (Al, Ni, Mn, Ti и Sn), нержавеющая сталь;

- глины, керамики, природные минералы, песок, активированный уголь.

Наиб: макропористые стекла, силикагели («-»: повышенная р-римость при высоких рН р-ров; малая механич прочность; неспецифическая адсорбция). Их модифицируют для уменьшения р-римости так, чтобы на их пов-ти образовывалась пленка окислов металлов (Zr, Al и Ti).

«+»: дешевизна; возм-ть варьирования составом; высокая прочность.

3. смешанные (на основе акриламида и агарозы (ультрогели), сополимеры акриламида и малеинового альдегида, метакриловой кислоты и т.д.)

Способы иммобилизации ферментов.

Факторы, учитываемые при иммобилизации:

-природа функциональных групп белковых молекул;

-характеристика катализируемой реакции (природа субстрата);

-положение активного центра;

-наличие (отсутствие) простетических групп и других небелковых компонентов.

Физические и химические способы иммобилизации.

1.Физические способы:

- адсорбционные (закрепление фермента на носителе происх на его пов-ти за счёт электростатич, гидрофобных, водородных связей, дисперсионных вз-ий)

«+» возм-ть регенерации.

- механические (включ в гель, микрокапсулы, волокна, мембраны, двухфазные системы и т.д.)

Физические методы наиб часто прим-ся в пром-ти. В кач-ве носителей исп-ют прир полимеры, полистиролы, полиакриламиды, ПАВ, неорг носители. Пр: амилазы, β-галактозидаза, глюкоамилаза, глюкозоизомераза, липазы, целлюлазы, каталаза и т.д.

2. Химические методы (прикрепл фермента к носителю с помощью ковалентных связей)

«+»: прочность при разл рН, Т (фермент не вымывается); возм-ть изм-я св-в фермента (специфичность, акт-ть, стабильность); меньше влияние матрицы на фермент.

«-»: инактивация фермента; сложн-ть закрепл ферментов, имеющих кофакторы; сложн-ть закрепления ферментов, имеющих субъединичное строение.

Способы прикрепления:

1) Н — С — Ф;

2) Н — Ф;

3) С — Ф (Ф — С — Ф).

В кач-ве сшивающих агентов исп-ют значит число соед-ий с различными функциональными группами (глутаровый альдегид, галогенцианы (бромциан), изоцианиды, п-нитробензоилхлорид и др.). Часто перед присоед-ем белка к носителю белок и носитель активируют, т.е. вводят реакционноспособные группы, по которым и будет в дальнейшем производиться сшивание.

Этим способом иммобилизованы алкогольдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, каталаза, глюкозооксидаза, ксантиноксидаза, инвертаза и ряд др ферментов.

Соврем направление — иммоб-ция целых клеток МО, раст и животных (как полиферментных систем).

Биотрансформация витаминов

1933 – разработан метод Крихштейна. Это хим-ферм метод. Собственно стадия биотрансформации - р-ция превращения D -сорбита в L -сорбозу.

Применяются ферменты: сорбитдегидрогеназа исключительно МБ трансформ.

Acetobacter suboxydans, Ac. xylinum

Хим способом D-глюкоза в D-сорбит с восст-ем газообразного водорода и исп-ем Pd-Ni катализатора

Из 2 кг Glu по этому методу получ до 1 кг витС (около 1кг) в ферментерах с аэр(степ аэр = 1) и перемеш.

ПС: -р-р Д-сорбита (конц в зав-ти от штамма) 10-20%

- для увеличения выхода подпитка до 35%

- источник азота: кукурузный экстракт 0,1-0,3%

- мел (до 1%) для поддержания рН = 5,0 – 6,0

24 часа, Т=30-35С, выход L-сорбозы = 87%

Посевной мат-л готовят инкубированием продуцента в течении 20 часов на среде, сод-щей 20% сорбита