Глава 7

Получение гаплоидов и манипуляции с плоидностью для повышения эффективности селекции растений

Гаплоидами у покрытосеменных растений называют особи, имеющие гаметический набор хромосом по отношению к уровню плоидности родительской особи. Удвоение хромосом у гаплоидов диплоидных видов (получение удвоенных гаплоидов) позволяет получать гомозиготные линии, которые представляют значительный интерес для селекции.

Гаплоиды могут возникать естественным путем в результате нарушения процесса оплодотворения из неоплодотворенных яйцеклеток или других клеток зародышевого мешка, при элиминации хромосом одного из родителей в зиготе или замещении ядра яйцеклетки ядром спермия. Первым растением, которое было идентифицировано в качестве гаплоида, был дурман Datura stramonium (Solanacea), выявленное A.F. Blakeslee в 1921 году. Позже гаплоиды были обнаружены и у многих других растений, однако частота их появления в природе оказалось крайне незначительной (0,001 – 0,01%) и не могла удовлетворить потребности генетики и селекции.

Разработка методов культуры клеток растений in vitro дала возможность получать в эксперименте гаплоиды и удвоенные гаплоиды с частотой, намного превышающей естественный уровень. Для многих видов растений разработаны эффективные технологии, позволяющие использовать гаплоиды и манипуляции с плоидностью для ускорения селекционного процесса, снижения его трудоемкости.

В настоящее время для редукции числа хромосом у растений применяют два основных подхода, в основе которых фундаментальное свойство тотипотентности половых клеток. Первый из них предполагает получение гаплоидных растений-регенерантов путем андрогенеза (от греч. andros – мужчина и… генез) в культуре in vitro пыльников или микроспор, второй – путем гиногенеза (от греч. gyne – женщина и… генез) из неоплодотворенных яйцеклеток или других гаплоидных клеток зародышевого мешка в культуре in vitro, а также из имеющих гаплоидный зародыш семян, полученных при опылении материнского растения пыльцой другого вида или специального гаплоиндуктора. В последнем случае появление гаплоидного зародыша связано с индуцированным чужеродной пыльцой развитием неоплодворенной яйцеклетки (партеногенеза, от греч. parthenos – девушка и… генез), либо избирательной элиминацией в зиготе хромосом опылителя или материнского растения.

7.1. Культура in vitro пыльников и микроспор

Высшие растения имеют жизненный цикл, в котором чередуются фазы гаплоидного гаметофита и диплоидного спорофита. Во время фазы гаметофита материнские клетки пыльцы, находящиеся в пыльнике, претерпевают мейотическое и митотическое деления, результатом которых является образование мужского гаметофита – пыльцевых зерен. Под воздействием определенных воздействий в условиях культуры пыльников in vitro некоторые микроспоры способны менять программу развития с гаметофитной на спорофитную и давать, в результате, начало эмбриоидам или образовывать каллюс. Из эмбриоидов или каллюса можно получить растения-регенеранты, которые являются гаплоидами или удвоенными гаплоидами. Это явление получило название андрогенеза или пыльцевого эмбриогенеза (pollen embryogenesis, microspore embryogenesis). В русскоязычной литературе для его обозначения также используется термин андроклиния.

Возможность получения гаплоидов путем культивирования in vitro пыльников растений впервые была продемонстрирована в 1964 г сотрудниками Отдела ботаники Университета г. Дели (Индия) S. Guha и S.C. Maheswari. Они обнаружили формирование эмбриоидов в культуре пыльников дурмана Datura innoxia, которую собирались использовать для изучения биохимии мейоза. Позднее было установлено, что эмбриоиды происходили из незрелых пыльцевых зерен (микроспор) и имели гаплоидное число хромосом (Guha, Maheswari 1966).

В 1973 году французские ученые С. Nitsch и В. Norreel впервые получили гаплоидные эмбриоиды путем культивирования in vitro микроспор Datura innoxia, изолированных из пыльников.

Первоначально для получения культуры микроспор пыльники вскрывали скальпелем и их содержимое высвобождалось в жидкую питательную среду. Однако эта процедура была весьма трудоемкой, а выход микроспор был невысоким. В дальнейшем этот метод был усовершенствован: для лучшего извлечения микроспор применили магнитную мешалку. Кардинальное улучшение эффективности выделения микроспор было достигнуто благодаря использованию механической гомогенизации бутонов, содержащих пыльники с микроспорами на определенной стадии, пропусканию гомогената через сито, центрифигированию в градиенте плотности. Например, эффективная технология выделения микроспор пшеницы для культуры in vitro включает следующие этапы (по Zheng, 2003).

1. Колоски, погруженные в питательную среду, измельчают с помощью блендера. Важно подобрать оптимальную скорость вращения ножа блендера и продолжительность гомогенизации.

2. Полученный гомогенат фильтруют последовательно через сетчатые фильтры с размером ячеек 100 μм и 38 μм, чтобы отделить микроспоры от грубых остатков тканей и клеток.

3. Микроспоры, собранные на фильтре с размерами ячеек 38 μм, смывают раствором 0,3 М маннитола, наслаивают на 0,58 М раствор мальтозы и центрифугируют при небольшой скорости (100-150g). Жизнеспособные эмбриогенные микроспоры располагаются на границе этих двух растворов, в то время как другие клетки и примеси оказываются в осадке. Фракцию микроспор несложно собрать с помощью автоматической пипетки и перенести в жидкую питательную среду для культивирования.

Несмотря на то, что культура пыльников растений представляется более простой технологией для использования в селекции по сравнению с культурой микроспор, последняя имеет ряд преимуществ. Применение культуры микроспор позволяет существенно сократить трудозатраты, связанные с получением андрогенетических гаплоидов, так как процедура извлечения пыльников из бутонов у многих видов растений весьма сложная. Исключается возможность получения растений-регенерантов не из микроспор, а из соматических клеток, устраняется негативное воздействие на развитие микроспор окружающих тканей пыльника (правда, во многих случаях эти ткани могут оказывать и положительное влияние на развитие эмбриоидов). Культура микроспор является удобной модельной системой для изучения механизмов андрогенеза, проведения исследований, связанных с использованием экспериментального мутагенеза и генно-инженерных модификаций.