3.2.3. Внесение раствора конъюгата
Во все лунки стрипов внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Стрипы закрыть пленкой и выдержать в течение 30 мин при температуре (37±1)°С. Содержимое лунок удалить, лунки промыть, как описано в п. 3.2.2.
3.2.4. Внесение раствора тмб
Во все лунки добавить по 100 мкл рабочего раствора ТМБ, приготовленного непосредственно перед использованием. Стрипы закрыть пленкой и выдержать в защищённном от света месте при температуре 18–25°С 25 мин до развития синего окрашивания субстратной смеси в лунках с К+.
Ферментативную реакцию остановить, добавляя во все лунки по 100 мкл раствора стоп-реагента (при этом цвет в лунках меняется на желтый).
В случае попадания на кожу раствора ТМБ или стоп-реагента необходимо немедленно смыть их водой с мылом.
4. Регистрация и оценка результатов
Учёт результатов при скрининге сывороток проводят с помощью анализатора колориметрического иммуноферментного, регистрируя оптическую плотность (ОП) в лунках планшетов при длине волны 450 нм.
Оценку результатов проводят только в том случае, если регистрируемая ОП в лунках с положительным контрольным образцом не менее 0,5 о.е.; с отрицательным контрольным образцом не более 0,3 о.е.; отношение показателей ОП контрольных диагностического и отрицательного образцов должно быть не меньше 2,1.
При учёте результатов исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если значение её ОП в разведении 1:100 превышает значение ОП диагностического контрольного образца на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр в ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором значение её ОП равно или превышает значение ОП диагностического контрольного образца.
При использовании данного набора возможно выявление IgG к антигенам двух и более гельминтов в одном образце сыворотки. Это может быть связано как с совместной инвазией, так и со взаимодействием антител с гетерологичным антигеном за счет иммунологических перекрёстов между антигенами. В последнем случае для испытуемой сыворотки титр IgG к гомологичному антигену выше титра IgG к гетерологичному антигену.
5. Условия хранения и транспортирования
В соответствии с СП 3.3.3.1248-03.
Набор хранят при температуре от 2 до 8°С в сухом месте. Не подлежит замораживанию.
Транспортирование осуществляется всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 8°С. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25°С не более 3 суток.
Срок годности набора — 6 месяцев со дня выпуска.
Рекламации на качество тест-системы направлять в ЗАО “Вектор-Бест” по адресу: 630559, Новосибирская обл.,
Рекламации на качество тест-системы направлять в ЗАО “Вектор-Бест” по адресу: 630559, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Кольцово, а/я 121, тел. (3832) 36-73-46, 32-37-58, тел./факс (3832) 36-60-30, 32-67-49, 32-67-52, E-mail: vbobtk@vector-best.ru www.vector-best.ru
Очистка
Вирусный концентрат подвергается двойному зональному ультрацентрифугированию в градиенте сахарозы. После такой очистки происходит расщепление вирусов на составляющие антигены с помощью Октоксинол-9 (до 1997 года применялся твин-эфир). С 1998 года в производство вакцины Ваксигрип была введена дополнительна стадия очистки с использованием Тритон Х-100. Уже разрушенные вирусы подвергаются дополнительному инактивированию с помощью формальдегида, после чего концентрат антигенов подвергается фильтрации. На этом этапе заканчивается производство моновалентных вакцин, т.е. содержащих только один штамм вируса гриппа.
Поскольку для создания вакцин необходимо получение протективного антигена в достаточных количествах, то, прежде всего, нарабатываются большие объемы биомассы (культивируемые бактерии, вирусы). Далее производится выделение и очистка протективного антигена, причем в зависимости от условий это может быть как живая биомасса, так и инактивированная. Для инактивации используют формалин, фенол, перекись водорода, тепло, УФО-облучение и т.д.
Выделение и очистка протективного антигена также сопряжены с физическими или химическими методами воздействия, что определяется в основном свойствами антигена. Это могут быть методы изоэлектрического осаждения кислотами и щелочами, высаливание нейтральными солями, осаждение спиртом, сорбция и элюция, ультрафильтрация, колоночная хроматография и т.д.
Важно, что при всех указанных действиях должна максимально сохраняться первоначальная структура протективного антигена и в то же время должна быть получена максимальная степень чистоты препарата [11].
Обращаюсь вот с какой просьбой: помогите пожалуйста с методом по очистке антител, специфичных к пришитому на никель-агарозу антигену. Какие условия элюирования? Как не смывая лиганд очистить антитела?
Anonymous, 22.12.2003 15:11
Не понял, если антиген пришит, то почему на никель? Он что, с гистидинами? Вообще по стандарту сажают антитела из хорошо центрифугированной или фильтрованной сыворотки, можно еще фильтрованной через агарозу с другим антигеном, от посторонних антител. Потом промывают PBS, слегка понижают рН примерно до 5 слабым буфером с такой же ионной силой, элюируют концентрированным буфером рН 2.5 с 1М NaCl и 10% глицерина, чтобы разбить комплекс антиген-антитело, и моментально впрыскивают щелочной буфер такой же емкости для нейтрализации кислоты.
|
Методы скрининга антител Все методы скрининга активности и специфичности антител основаны на детекции взаимодействия антигена с антителом. В гибридомной технологии чаще всего используют различные варианты иммуноферментного анализа(см.глава ) и иммунофлюоресценцию. Радиоиммунологический метод более чувствительный, но не во всех лабораториях есть условия для работы с изотопами. Обычно приходится тестировать активность большого количества гибридом или клонов. Поэтому основные требования к методу детекции - это быстрота и надежность. Выбранный метод скрининга должен быть хорошо отработан до начала гибридизации. Методы преципитации, агглютинации не могут быть использованы, так как моноклональные антитела специфичны к одной детерминанте и не могут образовать множественных связей с антигеном. Для выявления клеточных антигенов обычно используют непрямой иммунофллуоресцентный или иммунопероксидазный методы на клетках и срезах тканей. |
|
Метод непрямой иммунопероксидазной реакции на депарафинизированных срезах тканей
|
|
Размножение клонов и массовая наработка антител Клоны, синтезирующие нужные антитела размножают in vitro в культуре или in vivo в брюшной полости животного идентичного по антигенам гистосовместимости. Если сливают мышиную миелому с лимфоцитами другого вида (крыса, человек), то иммунологическую реактивность мыши необходимо подавлять. В таких случаях используют мышей nude, либо предварительно мышей облучают. При росте в культуре гибридные клетки должны поддерживаться в логарифмической фазе роста в концентрации не выше 0,5 млн/мл. Клетки наращивают в культуральных флаконах увеличивающихся размеров. Ускорению роста гибридом может способствовать добавление фидерных клеток. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах). При обычных методах культивирования в супернатантах культур содержится 10-100 мкг/мл. антител. Более высокие концентрации удается получить в ферментерах на средах с низким содержанием ЭТС и добавлением определенных препаратов(до 660 мкг/мл). Схема получения асцитов В брюшной полости животных в асцитах вырабатывается до 1-25 мг/мл антител. Для получения асцитов перед введением гибридных клеток ( в период от трех дней до одного месяца) внутрибрюшинно инъецируют 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекан) или неполный адьювант Фрейнда, которые повышают способность гибридом расти в брюшной полости. Асцитную жидкость можно собирать, начиная с 14 дней после введения пристана или адьюванта. |
|
Очистка антител Чаще всего чистые антитела выделяют из асцитической жидкости. Супернатанты культур можно использовать без предварительной очистки в иммуноферментных и иммуногистохимических анализах. Если антитела необходимо получить в чистом виде, то сначала определяют их класс и подкласс. Для идентификации класса антител применяют набор антител специфических к отдельным классам и подклассам мышиных иммуноглобулинов, которые выпускают многие фирмы. Грубую иммуноглобулиновую фракцию получают высаливанием белков сульфатом аммония (45% насыщения) с последующим диализом. Затем можно использовать различные методы аффинной и ионообменной хроматографии. Хроматографией на сефарозе с пришитым ковалентно белком А, обладающим высоким сродством к Fc фрагменту антител, можно очистить иммуноглобулины мыши (IgG2a, IgG2b, IgG3). Методы очистки антител описаны в гл. |