54. Специфічна трансдукція у бактерій

Трансдукция это процесс передачи ДНК от клетки-донора клетке-реципеенту при участии бактериофагов. Различают 2 вида трансдукции: неспецифическую (общую), при которой может быть перенесен любой фрагмент ДНК хозяина, и специфическую, затрагивающую лишь строго определенные фрагменты ДНК. Наиболее известным примером специфической трансдукции служит трансдукция, осуществляемая фагом λ. Этот фаг при переходе в состояние профага включается в определенный участок хромосомы бактерии-хозяина – между генами gal u bio. Отделение фаговой ДНК от бактериальной хромосомы может произойти неточно, какой-то фрагмент ее останется в хр-ме, а близко расположенные гены клетки-хозяина будут захвачены фаговой ДНК. Причиной этого может быть неправильная рекомбенация. В случае заражения фагом клеток, дифектных по опред. гену, напр. gal- , может произойти рекомбинация с заменой собственного дефектного гена бактерии интактным трансдуцированным геном; при этом образуются рекомбенанты gal+ . Предпосылкой для успешного переноса генов при специфической трансдукции является интеграция фага в геном клетки-хозяина.

55. Генетическая трансформация у бактерий.

Трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Трансформация у бактерий — явление, наблюдаемое в лаборатории. В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста. В состоянии компетентности бактерии вырабатывают особый низкомолекулярный белок (фактор компетентности), активизирующий синтез аутолизина, эндонуклеазы и ДНК-связывающего белка. Аутолизин частично разрушает клеточную стенку, что позволяет ДНК пройти через неё, а также снижает устойчивость бактерий к осмотическому шоку. В состоянии компетентности также снижается общая интенсивность метаболизма. Возможно искусственное приведение клеток в состояние компетентности. ДНК необратимо адсорбируются на ДНК-связывающем белке, после чего одна из нитей разрезается эндонуклеазой на фрагменты длиной 2—4 тыс. пар оснований и проникает в клетку, вторая полностью разрушается. В случае, если эти фрагменты имеют высокую степень гомологии с какими-либо участками бактериальной хромосомы, возможна замена этих участков на них. Общее время процесса не превышает нескольких минут. Для проверки эффективности используют мутантов, устойчивых к антибиотикам, тяжелым металлам, другим ингибиторам; устойчивых/чувствительных к действию температуры, рН – наиболее простые и выгодные; либо мутантов по метаболизму – ауксотрофных мутантов (утрачивают или имеют не свойственные виду ферменты).

56. Механизм репликации днк у прокариот. Гипотеза репликона.

Деление молекулы ДНК (репликация) происходит по полуконсервативному механизму и в норме всегда предшествует делению клетки. С помощью электронного микроскопа установлено, что репликация ДНК начинается в точке прикрепления кольцевой хромосомы к ЦПМ , где локализован ферментативный аппарат, ответственный за репликацию. Часто можно обнаружить, что контакт ДНК с ЦПМ осуществляется посредством мезосом . Репликация, начавшаяся в точке прикрепления, идет затем в двух противоположных направлениях, образуя характерные для кольцевой хромосомы промежуточные структуры. Возникающие дочерние хромосомы остаются прикрепленными к мембране. Репликация молекул ДНК происходит параллельно с синтезом мембраны в области контакта ДНК с ЦПМ. Это приводит к разделению (сегрегации) дочерних молекул ДНК и оформлению обособленных хромосом. Модель строения бактериальной хромосомы должна объяснять также прохождение в клетке процессов транскрипции и трансляции . Согласно существующим представлениям суперспирализованные петли соответствуют неактивным в данное время участкам ДНК и находятся в центре нуклеоида . По его периферии располагаются деспирализованные участки, на которых происходит синтез информационной РНК (иРНК) , при этом, поскольку у бактерий процессы транскрипции и трансляции идут одновременно, одна и та же молекула иРНК может быть одновременно связана с ДНК и рибосомами. У прокариот и, в частности, у бактерий E. coli, описаны три ДНК- полимеразы - Pol I , Pol II и Pol III , первая из которых ответственна главным образом за репарацию ДНК, третья - за репликацию ДНК, а функция второй - в замене Pol III в крайних ситуациях, таких, например, как мутагенная репарация ДНК. Cинтез ДНК в репликационной вилке происходит на двух нитях ДНК одновременно в виде "непрерывного" синтеза на так называемой "ведущей" нити и "прерывистого" синтеза (фрагментами Оказаки) на "отстающей" нити. ДНК-полимераза синтезирует ДНК только в одном направлении: от 5'- конца к 3'-концу, перемещаясь вдоль ДНК-матрицы в направлении 3'->5'. Так как комплементарные цепи ДНК антипараллельны, ДНК- полимераза не может реплицировать молекулу ДНК, просто перемещаясь от одного конца матричного дуплекса к другому. Поэтому на одной цепи ДНК синтез новой цепи происходит непрерывно, и образующаяся цепь называется ведущей , тогда как синтез другой цепи осуществляется прерывисто в виде коротких фрагментов, получивших название фрагментов Оказаки Вновь синтезируемая цепь ДНК называется отстающей . И хотя фрагменты Оказаки также синтезируются в направлении 5'->3', перемещение работающей ДНК-полимеразы при синтезе каждого индивидуального фрагмента Оказаки должно быть противоположным перемещению при синтезе ведущей цепи. Образующиеся фрагменты Оказаки отстающей цепи соединяются друг с другом с помощью ДНК-лигазы. В соответствии с моделью Жакоба репликоном называют молекулу ДНК, способную к автономной репликации. Репликон содержит все необходимые гены и регуляторные последовательности, которые обеспечивают регулируемое удвоение его ДНК. Участок репликона, в котором начинается репликация, получил название репликатора или области начала репликации.