Рестриктные карты

При исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей нуклеотидов, включающих исследуемые гены, строят их рестрикционные карты . Рестрикционные карты представляют собой схемы, изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции является не чем иным, как строго определенной последовательностью нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты заключают в себе информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков генома.

Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по методу Е. Саузерна. Клонированный фрагмент ДНК отдельно или в составе вектора получают в препаративном количестве, затем его обрабатывают соответствующими рестриктазами и продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле. Количество образовавшихся рестрикционных фрагментов ДНК, обнаруживаемых после окрашивания бромистым этидием в виде флуоресцирующих полос в ультрафиолетовом свете, соответствует количеству сайтов рестрикции в том случае, если различия в размерах образовавшихся фрагментов ДНК достаточны для их разделения при электрофорезе.

Размеры рестрикционных фрагментов оценивают путем сравнения их электрофоретической подвижности с таковой фрагментов ДНК известных размеров. Получив информацию о количестве сайтов рестрикции в гене, далее определяют их взаимное расположение. Для этого в качестве зондов выбирают короткие фрагменты ДНК и после введения в них радиоактивной метки гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК, которые после электрофоретического разделения в агарозном геле были перенесены на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. По завершении гибридизации положение фрагментов ДНК, связавших метку, на фильтрах обнаруживают с помощью авторадиографии. Получение такой информации о принадлежности конкретных фрагментов ДНК, образовавшихся под действием различных рестриктаз, к 5'- или 3'-концевым частям исследуемой последовательности нуклеотидов обычно бывает достаточным для определения взаимного расположения различных сайтов рестрикции на рестрикционных картах.

Принцип построения рестриктных карт был предложен D. Nathans в начале 70х годов [ Nathans D., 1979 ] для построения карты генома вируса SV40. Им было предложено определение рестриктной карты как списка рестриктных сайтов, встречающихся в данной последовательности с указанием порядка их расположения и расстояний между ними, и принципиального способа их получения - анализ двойных и одинарных рестриктов.

Достоинством рестриктных карт является то, что информация, которая в них содержится, может быть использована непосредственно для клонирования интересующих фрагментов генома. Результаты же анализа этих фрагментов можно использовать для получения STS из данной области генома или для упорядочения ранее полученных маркеров. Кроме того, для их построения не требуется предварительного клонирования изучаемой ДНК.

До середины 80х годов были разработаны основные методы рестриктного картирования и получены полные рестриктные карты некоторых организмов, в основном вирусов. Однако, существовавшие методы разделения нуклеиновых кислот позволяли анализировать фрагменты размером до 30-40 килобаз. Таким образом, получение рестриктной карты даже такого сравнительно простого генома, как геном E. coli (длина около 6 Мб), представляло собой практически неразрешимую задачу.

Анализ генома млекопитающих осложнялся кроме того тем, что известные в то время рестриктазы имели сайты узнавания, которые встречались слишком часто. Это приводило к тому, что существовал разрыв в масштабах расстояний, картируемых с помощью генетических методов (методы классической генетики позволяют картировать исследуемый локус относительно соседних с точностью 2-5 сМ при размере генома мыши 1300 сМ и генома человека 3300 сМ, при этом 1 сМ у мыши соответствует в среднем 2000 килобаз, а у человека - 1000 килобаз) и расстояний, которые можно было откартировать с помощью рестриктаз (максимум несколько сотен килобаз).