Методы исследования агрегационной функции тромбоцитов

Гемолизат-агрегационный тест основан на способности гемолизата отмытых эритроцитов, исследуемого в разведении 10-2 и 10-6, вызывать при помешивании агрегацию в его же плазме, одержащей большое количество тромбоцитов (соотношение объемов цитратной плазмы и гемолизата — 1,0:0,2). Учитываются время появления агрегации (норма при высокой концентрации гемолизата—11—17 с, при низкой — 40—54 с) и ее выраженность. Динамика процесса и его интенсивность могут оцениваться также фотометрически (медицинский колориметр, зеленый светофильтр, помешивание) и на агрегографе любой конструкции.

При графической регистрации процесса использование высокого разведения гемолизата (10-6) позволяет получить двухволновую агрегатограмму, в которой вторая волна связана с выходом из тромбоцитов эндогенных стимуляторов агрегации — АДФ, катехоламинов, тромбоксана и др. Эта вторая волна характеризует реакцию освобождения, ее не наблюдается при отсутствии в тромбоцитах плотных гранул (болезни пула хранения) или при нарушении реакции освобождения (аспириноподобный синдром и др.).

Гемолизат-агрегационный тест доступен для выполнения в любой лаборатории, не требует никаких специальных реактивов.

Визуальный микрометод определения агрегации тромбоцитов

Сущность его состоит в том, что полученная в условиях силиконирования венозная кровь стабилизируется двойным объемом 3,8 % цитрата натрия (соотношение 2,4:0,6 мл), ее центрифугируют 6 мин при 100 об/ /мин, после чего полученную богатую тромбоцитами плазму наносят по 0,02 мл на предметные стекла и смешивают с таким же объемом агрегирующих агентов — АДФ, тромбином, коллагеном, норадреналином или ристомицином. Конечные концентрации агрегирующих агентов в исследуемой плазме крови должны составлять:

АДФ 0,5*10-4 ммоль/л;

норадреналина — 0,015%;

тромбина — 0,125 ед/мл (концентрация коллагена подбирается опытным путем).

Возможно испытание как более низких, так и более высоких концентраций агрегирующих агентов. Подбор их концентрации может варьировать в зависимости от неодинаковой активности препаратов различного производства и при разной активности образцов, в связи с чем необходима предварительная подгонка концентрации каждого агента на нормальной плазме.

Смесь богатой тромбоцитами плазмы крови агрегирующего агента перемешивается покачиванием предметного стекла, на темном фоне с помощью лупы регистрируется время появления агрегатов в виде «снежной бури». При оценке результатов учитывается число тромбоцитов в плазме. Так, время АДФ-агрегации, возрастает с 27—37 с при 400 Г в 1 л тромбоцитов до 62—75 с при 50 Г в 1 л, а тромбин-агрегации — соответственно с 40—52 до 79— 106 с.

Графическая регистрация процесса агрегации

Графическая регистрация процесса агрегации под влиянием тех же агрегирующих агентов — весьма информативный метод функционального исследования тромбоцитов. Выполняется на агрегографах или.

При графической регистрации определяют не только время наступления агрегации, но и ее интенсивность (по величине отклонения кривой и площади агрегатограммы), наличие первой и второй волны агрегации — при использовании малых концентраций адреналина и АДФ (вторая волна характеризует реакцию освобождения), а также патологической дезагрегации.

Визуальное или графическое исследование агрегации тромбоцитов под влиянием ристомицина

Весьма важным является визуальное или графическое исследование агрегации тромбоцитов под влиянием ристомицина. Нарушается этот вид агрегации (конечная концентрация ристомицина 0,8—1,0 мг/мл) при одном из наиболее распространенных геморрагических диатезов — ангиогемофилии (болезни Виллебранда), а также при аномалии тромбоцитов Бернара—Сулье и при некоторых приобретенных видах угнетения синтеза фактора Виллебранда (уремия, иммунная ингибиция его и т. д.).

Количественное определение фактора Виллебранда в плазме крови

Количественное определение фактора Виллебранда в плазме крови проводится по ристомицин-агглютинации взвеси нормальных формалинизированных тромбоцитов в различных разведениях исследуемой бестромбоцитарной плазмы.

Метод важен как для диагностики ангиогемофнлии и вторичного угнетения синтеза этого фактора, так и для оценки тяжести поражения эндотелия (васкулиты, атеросклероз и др.) и наклонности к тромбозам, при которых содержание фактора Виллебранда в крови часто значительно повышается.

Уровень фактора Виллебранда свидетельствует о способности эндотелия синтезировать его (снижен при аигиогемофилии) и о степени поражения эндотелия при васкулитах, атеросклерозе и других заболеваниях, протекающих с поражением внутренней оболочки сосудов.

Для получения фиксированных нормальных тромбоцитов к богатой тромбоцитами плазме крови здоровых лиц добавляются последовательно 0,2 % раствор ЭДТА (0,5 мл на 5 мл плазмы) и через 2 мин — фиксирующий раствор (20 мл 40 % формалина в 1000 мл фосфатного буфера с 0,2 г ЭДТА, рН 6,4).

Смесь выдерживается при температуре +4°С не менее 1 ч, после чего она подвергается центрифугированию, удаляется надосадочная жидкость, а тромбоцитарный осадок дважды отмывается суспензирующим раствором (один объем 3,8 % раствора цитрата натрия и пять объемов изотонического раствора хлорида натрия; pH доводится до 7,4). Приготовленная взвесь нормальных формалинизированных тромбоцитов фасуется по 1 мл и хранится при температуре —20°С. Калибровочная кривая разведения строится с использованием бестромбоцитарной нормальной плазмы, с образцами которой смешиваются формалинизированные тромбоциты. Далее в смеси определяется ристомицин-агглютинация. По калибровочной кривой определяется количество фактора Виллебранда в исследуемой плазме крови. Фиксированные тромбоциты лучше сохраняются при добавлении в консервирующий раствор небольшого количества азида натрия.