Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра высшей нервной деятельности выявление флуоресцентного белка eGfp в мозге трансгенных животных

Отчет по задаче большого практикума

	Студента 4 курса кафедры ВНД Рогозина Павла Денисовича
	Преподаватель: Ивашкина Ольга Игоревна

Москва – 2012

Введение

Адаптация к изменяющимся условиям внешней среды – важнейшее свойство живых организмов. У животных, имеющих нервную систему, она несёт функцию адаптации, обеспечивая различные формы обучения.

На сегодня известно, что при обучении новая информация сначала находится в кратковременной памяти (секунды – часы после обучения), затем переходит в долговременную (часы-дни после обучения), некоторое количество информации сохраняется на всю жизнь. Эти виды памяти имеют различные механизмы функционирования, и могут быть разделены экспериментально.

Выяснилось, что в процессе перехода от кратковременной памяти к долговременной (консолидации) происходит сложный каскад молекулярных событий, приводящий к активации генетического аппарата клеток мозга, связанных с обучением. При этом в соответствующих областях мозга происходит следующая последовательность событий:

1. Увеличение числа транскриптов немедленных ранних генов через 15-30 минут после обучения новому навыку.

2. Увеличение количества регуляторных белков и транскрипционных факторов, «ранних генов», спустя 1-2 часа после обучения.

3. Увеличение числа транскриптов «поздних генов» спустя 2-5 часов после обучения.

4. Увеличение уровня эффекторных белков (факторов роста нервов, белков синаптогенеза, эргичности нейронов, миелинезации) через 6-8 часов после обучения.

При исследовании экспрессии немедленных ранних генов, таких, как zif268, c-fos, обнаружили, что максимальный уровень их экспрессии наблюдается при получении животным новой информации. При потере информацией новизны уровень экспрессии этих генов день ото дня снижается, пока не вернётся к некоторому базальному уровню, присущему этим генам в данной структуре. Например, если бить крысу током в некоторой знакомой ей обстановке в течение 10 дней, уровень экспрессии c-fos сразу после ударов током будет постепенно снижаться, пока не достигнет уровня экспрессии у крысы, содержащейся в такой обстановке без ударов током (уровня пассивного контроля, ПК). Однако, если на 11 день не бить животное током в этой же обстановке, уровень c-fos снова возрастёт до значения после удара током в первый день. Таким образом, увеличение уровня экспрессии ранних генов в клетке сигнализирует о получении клеткой новой информации (рассогласования со старой информацией).

При введении в клетку в антисмысловых последовательностей мРНК к c-fos или zif268,или же блокатора синтеза белка в соответствующие временные интервалы после обучения, переход информации в долговременное состояние не происходит, что подтверждает роль немедленных ранних генов в консолидации памяти.

Для исследования процессов обучения и памяти часто используется модель условно-рефлекторного замирания, в которой животное обучается связывать условный стимул (звук, свет, обстановка и др.) с последующим болевым ощущением (электрокожной стимуляцией). При получении первого удара током животное подпрыгивает, а затем замирает: не совершает никаких движений, кроме дыхательных. При последующей подаче УС без удара током животное сразу замирает, что говорит о степени запоминания УС. Замирание – одна из естественных реакций страха, позволяющая мелким животным остаться незаметным для хищника.

Выявлять уровень экспрессии генов можно различными методами.

Метод иммуногистохимического окрашивания срезов мозга позволяет с помощью конструктов из антител и красителя, связанного с ними, обнаруживать области мозга, где происходило связывание антител с интересующим белком. Этот метод позволяет выявлять одновременно несколько белков в клетке при использовании красителей разного цвета.

Другим методом является использование трансгенных животных. На стадии оплодотворённой яйцеклетки можно с помощью генно-инженерного конструкта поместить под промотор интересующего нас гена ген GFP. Из полученного потомства методами селекции получают и поддерживают линию гетерозиготных по GFP животных, которых и используют в экспериментах.

GFP – Green Fluorescence Protein, белок, обладающий свойством флуоресценции, был получен из медузы Aequorea Victoria. При освещении его светом определённой длинной волны, он флуоресцирует, что позволяет легко выявлять GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. Таким образом, при экспрессии интересующего нас белка, в той же клетке будет экспрессироваться и GFP, что позволяет отследить количество интересующего белка. Возможно создание генных конструктов, где GFP не сцеплен с белком интереса и после синтеза просто накапливается в цитоплазме, или же сцеплен (fusion), тогда он выявляется точно там, где и белок интереса. В нашей задаче использовался первый вариант. На сегодня получено множество цветовых вариаций флуорецирующих белков, что также позволяет выявлять несколько белков интереса в клетке.

Для определения генотипа животных используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами к флуоресцирующему белку.

При использовании трансгенных животных можно снимать уровень флуоресценции как со срезов мозга различной толщины (клеточное разрешение), так и с коры изъятого мозга (структурный уровень). В нашей работе использованы оба метода.

Цели

1. Изучить изменения в экспрессии гена zif268 при обучении в модели условно-рефлекторного замирания у мышей линии zif e-GFP.

Задачи

1. Выработать у животных навык условно-рефлекторного замирания.

2. Провести качественный и количественный анализ изменения уровня экспрессии zif268 в структурах связанных с обучением.

3. Провести генотипирование экспериментальных животных.

Методика

Объект

Взрослые самцы мышей линии Zif-еGFP были разделены на две группы ОП (опытная) и ПК (пассивный контроль). Животных метили спиротовым маркером у основания хвоста.

Обучение в модели условно-рефлекторного замирания.

Обучение проводили в тёмной камере с установленной инфракрасной камерой для записи эксперимента. Автоматическую регистрацию двигательной активности животного вели с помощью программы Video Freeze (поставляется с камерой). Внутрипрограммный порог для движений был равен 20, временной порог движений - 5 фреймов. Для каждого из 3-х животных ОП группы провели обучение по следующей схеме:

1. Животное помещали в камеру, начинали регистрацию поведения в течение 3-х минут.

2. Спустя 2,5 минуты после посадки животного следовал удар током силой 1мА в течение 2-х секунд.

3. Спустя 3 минуты после посадки регистрация оканчивалась, животное извлекали из клетки за хвост и помещали обратно в клетку

4. До помещения и после изъятия животного камеру протирали спиртом.

Спустя 90 минут после обучения животное наркотизировали для проведения перфузии. За 15 минут до наркотизирования животных тестировали в той же камере, где обучали. При тестировании животное не подвергали удару током, а только регистрировали поведение в течение 3-х минут.

Перфузия

Наркотизировали животных путём внутрибрюшинного введения смеси золетила (40 мг/кг) и рометара (5 мг/кг) в физиологическом растворе из расчета 100 мкл/10 г веса животного. Для надёжности наркоза развели не на 6, а на 10 животных (12 мг порошка золетила, 75 мкл раствора рометара концентрации 20мг/мл, 3 мл физраствора). Вводили 300 мкл смеси всем мышам, независимо от веса. Наркотизированное животное перфузировали раствором фосфатного буфера (PBS, pH=7,4) в течение 3-х минут, затем 4-х процентным раствором параформальдегида (4% PFA) в течение 7 минут. После перфузии извлекали мозг и помещали в PBS изолированно от света на 4⁰ С для хранения.

Измерение уровня индуцированной флуоресценции коры больших полушарий

Количество общей флуоресценции оценивалось с помощью прибора Photon Imager. Для подсчёта в программе была выбрана только кора больших полушарий, без мозжечка и обонятельных луковиц. Помещённые в прибор вверх корой мозги предварительно подсушивались для предотвращения бликования. Флуоресценцию индуцировали длинной волны 488 нм, измеряли её уровень при длине волны 510 нм в течение 4-х секунд. Количество флуоресценции представили в стандартизованных единицах (ph/s/cm2/sr – число фотонов на квадратный сантиметр за секунду, к внутреннему параметру прибора).

Изготовление и съёмка срезов.

Срезы мозга делали на вибротоме Leica. Изготовили по три среза CA1 дорсального гиппокампа (-1,94 – -1,34 мм от Брегма) и цингулярной коры (-0, 34 – 0,98 мм от Брегма), толщиной 30-50 мкм. Мозг при резке находился в растворе PBS. Срезы помещали на стёкла, покрытые Poly-L-lysine.

Для съёмки срезов использовали микроскоп VS 110 Olympus и программу VS-ASW FL. Съёмку производили при выдержке 150 мс, автоматической настройке яркости.

Генотипирование мышей (ПЦР и электрофорец)

ПЦР

1. Биологический материал (кончик хвоста) поместили в лизисный раствор (500 мкл/пробу) на сутки при t=50⁰С

(для 6 проб – 2925 мкл лизисного буфера, 75 мкл 1% SDS, 1,5 мг протеиназы K).

Состав лизисного буфера для экстрации ДНК:

Реактив	Конечная концентрация
Tris-HCl (pH = 7,5)	0,01 М
EDTA (pH = 8)	0,01 М
NaCl	0,1 М

2. Отцентрифугировали лизат при 14800 об/мин в течение 30 минут

3. 450 мкл супернатанта смешали с 450 мкл изопропанола

4. Отцентрифугировали в течение 15 минут 14800 об/мин

5. Слили супернатант, к осадку прилили 1 мл 70% раствор этанола

6. Отцентрифугировали в течение 15 минут 14800 об/мин

7. Слили супернатант, оставили в открытом состоянии осадок сушиться до выветривания запаха этанола при t=50⁰С

8. Изготовили смесь для проведения ПЦР на 15 проб:

Реактив	Количество на 1 пробу (мкл)	Количество на 15 проб (мкл)
Screenmix (5x)	4	60
H2O	12.2	183
2 праймера к GFP	0,4 + 0,4	+ 6

9. Подогрели ДНК в буфере для элюции (ТЕ буфер) в течение 10-15 минут при 55° С

10. Добавили в каждую пробирку для проведения ПЦР 17 мкл смеси (п.8), после внесли образцы (3 мкл раствора ДНК в ТЕ буфере), перемешали пипетированием. Общий оббьем реакционной смеси – 20 мкл

11. Поместили пробы в амплификатор со следующим температурным режимом: 95 °C - 5 минут - 94 °C – 15 секунд - 65 °C - 0,5 минут - 72 °C – 40 секунд - 40 циклов - 72 °C - 5 минут.

Электрофорез

Проводили в агарозном геле (50 мл 2,5% агарозы в буфере), с ТАЕ буфером для электрофореза (55 мл ТАЕ, 1,375 мкл бромистого этидия), в аппарате для горизонтального электрофореза. Сила тока – 50 ампер при напряжении 100 вольт в течение 40 минут. В лунки вносили по 5 мкл образца. В качестве маркера массы использовали 6 мкл step ladder на лунку (4 мкл Н2О, 1 мкл синего красителя, 1 мкл DNA ladder). Для визуализации продуктов электрофореза использовали ультрафиолет (254 нм).

Результаты