Глава II материал и методы исследования

В основу работы положены экспериментальные исследования и клини­ческие наблюдения.

Экспериментальный раздел

Эксперименты поставлены на 48 взрослых беспородных половозрелых собаках обоего пола, массой от 5,9 до 14,1 кг, разделенных на две группы.

В первой группе исследований (24 животных) изучали морфофункцио­нальное состояние ткани кишечника по транскапиллярному обмену, крове­наполнению и биоэнергетике исследуемой ткани, при остром серозном пери­тоните. Выраженность процессов липопереокнеления определяли по содер­жанию первичных (диеновые и триеновые коньюгатов и вторичных (маало-новый диальдегпд) продуктов, активность фосфолипазы A_2j систему антиок-сидантной защиты оценивали по активности каталазы и супсроксиддисмута-зы в тканях кишки и плазме крови. Качественный и количественный липид-ный состав ткани кишечника и плазмы крови изучали по содержанию ацилг-лицеролов, свободных жирных кислот, эстерифицированного и неэстерифи-цированного холестерола, лизофосфолнлпдов, ефннгомнелина, фосфатидил-холина, фосфатндилсерина, фосфатидилинозита и фосфатидилэтаноламина. Эта группа исследований обозначена как первая (I).

Во второй группе исследований (24 животных) определяли морфо­функциональное состояние ткани кишечника, интенсивность процессов пе­рекисного окисления липидов, активность фосфолипазы А2 и ферментов ан-тиоксидантной защиты, качественный и количественный липидный состав ткани кишечника и плазмы крови при остром гнойно-фибринозном перито­ните. Эта группа исследований обозначена как вторая (II).

Для получения исходных данных был изучен уровень вышеперечис­ленных показателей в изучаемых тканях у 10 здоровых животных. Получен­ные результаты были приняты за норму.

Перитонит моделировали по способу Л.П. Власова (1991) таким обра­зом: Под общим обезболиванием, используя раствор тиопентала-натрия в расчете 0,04 г/кг массы тела, животным в брюшную полость шприцем вводи­ли 20 % каловую взвесь (0,5 мл/кг массы тела животного). В дальнейшем, животным первой группы через одни сутки после введения каловой взвеси выполнили срединную лапаротомию, производили санацию брюшной полос­ти, биопсию серозпо-мышечного слоя кишечника и забор венозной крови. Таким образом, животным моделировали острый серозный перитонит. Во второй группе исследований срединную лапаротомию и санацию брюшной полости с дальнейшим забором венозной крови и биопсией серозно-мышечного слоя кишечника выполняли через двое суток после введения ка­ловой взвеси в брюшную полость. Таким образом, моделировали острый гнойно-фибринозный перитонит. В контрольные сроки (1, 3, 5 суток) после санации брюшной полости животным проводили релапаротомию, биопсию серозно-мышечного слоя кишечника и забор крови из периферической вены для дальнейшего исследования.

В послеоперационном периоде экспериментальным животным прово­дили антибактериальную (раствор канашщина из расчета 15 мг/кг 2 раза в сутки в/м) и дезннтоксикационную (5% раствор глюкозы и 0,89% раствор хлорида натрия из расчета 50 мл/кг в/в) терапию.

Клинический раздел

Клинический раздел включает 90 больных острым перитонитом.

В первой группе (45 больных) исследовали морфофункциональное со­стояние кишечника при остром серозном перитоните;

Во второй группе (45 больных) - остром гнойно-фибринозном перито­ните.

Подробный анализ больных, подбор их в группы представлен в главе

YI.

В работе применялись следующие методы исследования:

1. Определение окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) для изучения электрогенеза тканей. Регистрацию показателя осущест- вляли на универсальном ионометре ЭВ-74 по методике, изложенной В анно- тации к прибору, где рабочий электрод — платиновый (платина 99,99 %, ГОСТ 85888-64), а электрод сравнения - хлорсеребряный.

Контрольными растворами служили 1,0 М феррацианиды составом K₄Fe(CN)₆/K₃Fe(CN)fv Отклонение индикаторной стрелки при Т - 25±1°С со­ставляло 250±4 мВ. Результат выражался в мВ.

2. Определение вено-венозного градиента но методу Ленд пса. Из- менение гистогематической проницаемости регистрировалось по капилляр- нон фильтрации (F) и потере белка (К) на основе следующих расчетов:

100-Hi

_{F = f00 Цм%}

Ht

i

где Ht, - гематокрит венозной крови (контрольные данные); Ht₂- гематокриг венозной крови (опытные данные).

100

где Ej- количество белка плазмы (контрольные данные); E^VyPp

Е₂- количество белка плазмы (опытные данные); E^V^-Pj,

V, - объем плазмы (контрольные данные);

V₂ - объем плазмы (опытные данные);

- процентное содержание белка плазмы (контрольные данные);

Р₂ - процентное содержание белка плазмы (опытные данные).

3. Определение коэффициента диффузии кислорода в тканях на ос­нове учета темпа падения диффузного тока восстановления по уравнению И.М. Эпштейна:

где Ii - сила тока через щ ма; 1₂ - сила тока через t₂, ма; г — радиус электрода, мм. Результат выражался в см /с.

4, Кровенаполнение тканей тонкой кишки. Количество крови в тка­нях определяли следующим образом: забирали кусочки ткани, который взвешивали и гомогенизировали в дистиллированной воде в соотношении 1:10. Гомогенат ткани центрифугировали в течение 15 минут при 6000 об/мин. Из вены брыжейки участка кишки, ткань которого исследовалась, за­бирали кровь и стабилизировали 5% раствором цитрата натрия. К 0,1 мл за­бранной крови добавляли 4,0 мл дистиллированной воды. Гсмолизат центри­фугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут. В три пробирки вносили по 1,0 мл дистиллированной воды, 1,0 мл реактива и 0,8 мл 3% перекиси водо­рода. В первую пробирку добавляли 0,2 мл супернатанта ткани, во вторую — 0,2 мл гемолизата (очищенного), а в третью - 0,2 мл дистиллированной воды (контроль на реактивы). Содержимое пробирок перемешивали и центрифуги­ровали в течение 5 минут при 6000 об/мин. Далее измеряли оптическую плотность проб при длине волны 540 им на ФЭКе. Длина оптического пути кювет была 10 мм.

Объем крови в ткани (V, мкл/г) рассчитывали по формуле:

V=((E1 - Е) * 5 * 1000) : ((Е2 - Е) х 2);

где Е1 - экстинция пробы ткани, Е2 - экстинция пробы крови, Е - экстинция пробы контроля на реактивы, 5 — объем крови в пробе (мкл),

2 — масса ткани в пробе (мг),

1000 — коэффициент пересчета из мг в г.

20. Экстракция липидов из тканей топкой гстпшсн (Хнгпшс Д. А., 1990), Осадок, полученный из гомогенизированных тканей ресуспензировали в стеклянных центрифужных пробирках, содержащих не менее 20 объёмов смеси хлороформ/метанол (2:1 по объёму). Пробирки с экстрактом закрывали стеклянными пробками и оставляли для полной солюбнлизации липидов на 1-1,5 ч. Затем денатурированный белок удаляли центрифугированием, а па-досадочную жидкость сливали в стеклянные центрифужные пробирки. Для полноты экстракции к осадку вновь приливали хлороформ-метанольную смесь и после центрифугирования супернатанты объединяли. К экстракту добавляли одну пятую объема 0,05 М хлорида кальция и тщательно переме­шивали. Для разделения на две фазы эмульсию оставляли на ночь в холо­дильнике или центрифугировали. Верхнюю фазу, состоящую из смеси хло­роформ/метанол/вода в соотношении 3:42:47 отбрасывали. Из нижней хло­роформной фазы получали препарат суммарных липидов.

21. Хроматографпческие методы анализа (тонкослойная хромато­графия), Лштиды фракционировали методом тонкослойной хроматографии на силикагелевых пластинах. Полярные фосфолипиды разделяли на пласти­нах фирмы Мегк на стеклянной основе, нейтральные липиды фракциониро­вали на силикагелевых пластинах для обращеннофазной тонкослойной хро­матографии (Россия). Перед разделением хроматографпческие пластины для удаления связанной воды и повышения разделительной способности силика-геля нагревали в течение 30-60 мин. при температуре 120"С.

Липиды разделяли в прямоугольных хроматографичеекпх камерах, вы­стланных изнутри фильтровальной бумагой для лучшего насыщения внут­реннего объёма парами растворителей. Образцы суммарных препаратов ли­пидов, растворенные в смеси хлороформ-метанол (2:1, по объёму), наносили микрошприцем фирмы "Hamilton" на расстоянии 1 -1,5 см от краев пластины. Для препаративного разделения раствор 2 мг липидов наносили в виде пря­

моугольной полосы. При аналитическом разделении нагрузка липидов со­ставляла 100-200 мкг на одну точку.

Фосфолнпиды фракционировали одномерно в системе растворителей хлороформ+метанол+ледяная уксусная кислота+вода (60:50:1:4, по объёму).

Нейтральные липиды разделяли, элюируя хроматографпческие сплика-гелевыс пластины в системе растворителей гексан+диэтнловый эфир +уксусная кислота (90:10:1, по объёму). На хроматограммах липиды обнару­живали 10% раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле, после на­гревания в течение 10 минут при температуре 90 С проявлялись интенсивно-синие пятна липидов.

Лнпиды на хроматограммах идентифицировал н с помощью специфи­ческих окрашивающих реагентов и свидетелей. Фосфолнпиды выявляли с помощью универсального реагента (Vaskovsky V.E. et al., 1975), приготов­ляемого из исходного реагента. Исходный реагент готовили, добавляя к 10 г натрия молибденовокислого в 60 мл 4 н НС1 0,4 г солянокислого гидразина в 14 мл 4 н НС1 и, нагревая смесь на водяной бане в течение 20 мин. Затем ох­лаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Для опрыскивания хроматографи-ческих пластин готовили смесь, состоящую из одного объема исходного реа­гента и семи объемов 7 н серной кислоты.

На хроматограммах после обработки указанным реагентом фосфолн­пиды обнаруживались в виде сине-голубых пятен. Фосфатидилэтаноламнн и фосфатидилсерин обнаруживали нингидршювым реактивом, опрыскивая хроматографпческие пластинки 0,15% раствором нингидрина в ацетоне и, нагреваядо 100^ВС

Аминосодержащие фосфолнпиды окрашиваются в краснофиолетовый цвет. Холинсодержащие фосфолнпиды обнаруживали с помощью реагента Драгендорфа (Marinetti Р., 1976). Реагент Драгендорфа готовили перед упот­реблением. Смешивая 20 мл раствора I, состоящего из 1,72 г основного вис­мута азотнокислого в 100 мл 20% ледяной уксусной кислоты и 5 мл раствора

1% приготовленного из 10 г йодистого калия растворенных в 25 мл воды. По­сле опрыскивания холннсодсржащие фосфолнпиды окрашивались в оранже­вый цвет.

22. Количественное определение липидов. Количественное определе­ние липидов проводили непосредственно на хроматограммах депептометри-ческим методом после их проявления 5% фосфорнованилиновоп кислотой в этаноле. Молекулярный анализ проводили на денситометре Model CS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowlware).

23. Определение диеновых п трненоных коныогатов. Спектрофото-мстрический метод определения продуктов ПОЛ основан на том, что диено­вые коныогаты обладают характерным поглощением при длине волны 232­233 нм [Ганстон, 1986]. Липиды из тканей и плазмы крови экстрагировали хлороформ-мстанольной смесью. Суммарный препарат липидов высушивали досуха на роторном вакуумном испарителе и остаток липидов растворяли в гексапе. Спектр поглощения регистрировали при длинах волн 190-275 нм на спектрофотометре СФ-46 (Россия).

Окпсленность липидов оценивали по величинам индексов окисленно-сти, рассчитываемых на 1 мг липидов по определению отношения А 232 /А 215 и А 275/А 215 (А - оптическая плотность при указанных длинах волн). Содержание диеновых и триеновых коныогатов выражали в усл.ед./мг липидов.

24. Определение содержания малонового дпальдегнда. Содержание малонового диальдегида оценивали в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТЕК). Для определения антиокислительной активности липидов предвари­тельно проводили индукцию липопереокисления раствором сульфата железа в концентрации 5 мкмоль в течение часа. Для этого к 1 мл плазмы крови или тканевого гомогената добавляли 3 мл 1% фосфорной кислоты, содержащей 0,5 ммоль ЭДТА и 1 мл 0,5% раствора ТЕК. Образцы перемешивали и инку­бировали 45 мин при 100°С. Затем образцы охлаждали и приливали 4 мл н­

бутанола, тщательно встряхивали и центрифугировали 15 мин при 1500 g. В верхней бутанольной фазе регистрировали спектр поглощения в области 515­550 нм. Определяли оптическую плотность при 532 нм, используя в качестве базовых точки спектра при 515 и 550 нм. Содержание ТБК-реагирующих продуктов выражали в имоль/г белка.

10. Определение активности фосфолипазы А₂, Солюбилизацию мембранных белков тканей и плазмы крови проводили с использованием 1,0% раствора тритон Х-100. Для этого к навескам ткани и плазме крови при­бавляли 0,5 мл 10 мМ раствора трис-НСЬ-буфера с 1% тритон Х-100 (15 мМ), рН 8,0. Гомогенизацию тканей, с целью полного извлечения белков, прово­дили с помощью стеклянного гомогенизатора со шлифованным пестиком (при температуре 37 С в течение 10 минут).

Для ннгибировапия сернновых протеаз в гомогенаты добавляли фе­нил метансульфонил фторид (10 мкМ). Для определения активности фермента к 1 мл ферментного препарата прибавляли 1 мл 10 мМ трис-НСЬ-буфера (рН 8,0), содержащего 150 мМ тритон Х-100, 10 мМ СаС1₂ и субстрат (1,2 мМ). В качестве субстрата использовали фосфатндилхолипы яичного желтка. К 1 мл тканевого гомогената яичного желтка приливали 3,75 мл емсен хлороформ-метанол (1:2, по объёму). Содержимое пробирки перемешивали и выдержи­вали в холодильнике в течение 2-3 часов, периодически встряхивая, затем центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин. Супернатант переносили в дру­гую пробирку, а к осадку приливали 4,75 мл смеси, состоящей из одной части хлороформа, двух частей метанола и 0,8 части воды. После повторной экс­тракции содержимое пробирки разделяли центрифугированием и суперна-танты объединяли. Для промывки и разделения на две фазы добавляли 2,5 мл хлороформа и 2,5 мл воды. Образующуюся эмульсию расслаивали центрифу­гированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Нижний хлороформный слон упаривали досуха с помощью роторного испарителя или в токе азота. Сухой остаток липидов растворяли в смеси хлороформ-метапод (2:1, по объёму) и

использовали в качестве субстрата (лецитин яичного желтка) для определе­ния активности фосфолипазы А₂.

Регистрацию каталитической деятельности фермента проводили на ус­тановке, состоящей из иономера ЭВ-74, электродной системы (электрод сравнения ЭВЛ-IM, измерительный электрод ЭСЛ-43-07), ультра-термостата и микробюреткн.

Активность Фосфолипазы А₂ оценивали титрометрнческим методом с помощью нейтрализации 0,02 М NaOH карбоксильных групп, выделяющихся свободных жирных кислот. Расчет проводили по калибровочной кривой, по­строенной по пальмитиновой кислоте и выражали в мкмоль/с/г белка.

11. Определение активности каталазы. Фотометрический метод оп- ределения активности каталазы основан на способности перекисей образовы- вать с молнбдатом аммония стойкий окрашенный комплекс. К 0,1 мл плазмы крови или эритроцитов приливали 2 мл 0,03% перекиси. В холостую пробу вместо сыворотки добавляли 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию оста- навливали через 10 мин добавлением 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Образцы центрифугировали при 8000 об/мин в течение 40 мин.

Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине 410 нм. Активность каталазы выражали в мг ЬЬО/мин/г белка.

12, Определение активности супсроксиддисмутазы- К 500 мг ткани приливали 3 мл фосфатного буфера (рН 7.4) и гомогенизировали до появле- ния однородной суспензии. После центрифугирования при 5000 об/мин в те- чение 15 минут отбирали 0,5 мл супернаганта и вносили в центрифужную пробирку, содержащую 1 мл хлороформно-спнртовой смеси (2:1, по объёму). Полученную смесь охлаждали, тщательно перемешивали и для удаления ге- моглобина центрифугировали. Водно-спиртовой слой, содержащий фермент отбирали и добавляли несколько капель насыщенного раствора КН2РО4. Ферментный препарат получали разбавлением полученной фазы в 20 раз.

В состав реакционной среды входили питросииий тетразолий (57 мкмоль), НАДН (98,5 мкмоль), феназннметасульфат (16 мшоль) и 0,2 мл

ферментного препарата, Нитросиний тетразолий используется как индика­тор, способный акцептировать электроны и восстанавливаться до формазана, имеющего максимум поглощения при 560 нм. Восстановленная форма би-формазан окрашена от синего до черного цвета. Нитросиний тетразолий бы­стро восстанавливают в присутствии феназинметасульфата флавопротеино-вые ферменты.

Феназинметасульфат используется в реакциях определения активности ферментов как переносчик электронов между ферментами и молекулярным кислородом или солями тетразолия. Реакция протекала 10 минут в 0,5 моль фосфатном буфере (рН 8,3) с ЭДТА (0,1 ммоль) при 25° С в аэробных усло­виях. В контрольную пробу ферментный препарат не вносили. Активность СОД рассчитывали по формуле:

А = Т%/(100%-Т%),

где А - активность фермента в условных единицах, рассчи­танная на 1 мг белка,

Т % - процент торможения реакции восстановления нитроси-

него тетразолия в пробе за минуту. Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики, с использованием критерия t Стьюдента. Вычисления произво­дили на CRU 199 MHz "Pentium-MMX" с помощью программы Microsoft Excel 2000. Использован текстовый процессор Microsoft Word 2000. Динами­ка показателей отражена на графиках, построенных с помощью программы электронных таблиц Microsoft Excel 2000.