Практикум по курсу «Медицинская синергетика»

ТЕМА:

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ В БИОФИЗИКЕ

СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССДЕДОВАНИЯ

МАКРОМОЛЕКУЛ

Исследование пространственной структуры

и динамики макромолекул.

МГТУ МИРЭА

Факультет ИТ

Кафедра «Прикладная синергетика»

2012 г.

1. Введение

1.1 Методические указания по выполнению лабораторных работ

(Общие положения).

Данная лабораторная работа выполняется в соответствии с учебным планом по дисциплине «Биофизика». Её цель – познакомить студентов с одним из экспериментальных методов исследования свойств биологических макромолекул, надмолекулярных и субклеточных структур; с принципом действия и устройством экспериментальных установок; особенностями методик проведения экспериментов и экспериментальными возможностями данного метода.

Выполнению работы должно предшествовать изучение теоретического материала (лекции и литературные источники). Описание лабораторной работы также содержит некоторые основные теоретические положения, лежащие в основе экспериментального метода. Лабораторная работа может считаться успешно выполненной, если получены правильные ответы на контрольные вопросы (задания) и приведены обоснования этих ответов со ссылками на соответствующие теоретические положения.

По лабораторной работе необходимо представить отчет, который должен содержать:

• название работы;

• цель работы

• задание по лабораторной работе, т. е., поставленные перед студентом вопросы;

• ответы на вопросы с теоретическим обоснованием;

• необходимые расчеты и графические иллюстрации;

• дополнительные сведения и соображения по теме лабораторной работы (по желанию студента).

2. Спектральные методы иссдедования

МАКРОМОЛЕКУЛ

1. Динамика белковой структуры.

Наиболее прямым мето­дом, позволяющим изучать пространственное строение белковых молекул, является рентгеноструктурный анализ. На основании данных рентгеноструктурного анализа белковая молекула пред­ставлялась статической системой, в которой неполярные аминокис­лотные остатки образуют жесткое гидрофобное ядро, приближа­ющееся по свойствам больше к твердому телу, чем к жидкости. Благодаря такой жесткости трудно ожидать заметных изменений конформаций при взаимодействии ферментов с субстратами.

Применение спектральных методов (ИК-спектроскопии, ЯМР, флуоресцентного анализа) для изучения белковых молекул заставило критически оценить результаты рентгеноструктурного анализа. Анализ данных водород-дейтериевого обмена в пептидных группах н динамического тушения флуоресценции триптофанилов внутрен­них областей интактных белков свидетельствует о несостоятельно­сти статической концепции белковой структуры и позволяет сфор­мулировать представление о динамических свойствах белков. Наблюдаемая внутримолекулярная подвижность, спонтанные флук­туации структуры белков обусловлены различного рода движени­ями атомов или групп атомов вблизи положения равновесия.

Для белков с известной пространственной структурой Ф. Ри­чардс с помощью специальных расчетов нашел локальные плот­ности и сопоставил их с распределением полярных и гидрофобных аминокислотных остатков по внутреннему объему белков. Оказа­лось, что внутри белка плотность значительно изменяется: есть области высокой плотности (= 1,4•10³ кг•м^-3), которым отве­чают высоко упорядоченные участки с -спиралями и -структурами, и области с низкой плотностью (=0,5•10³ кг•м^-3), куда, как правило, попадают гидрофобные аминокислотные остатки. На основании этих данных сделано заключение о неправомочности понятия гидрофобного ядра для глобулярных белков. По-види­мому, правильнее говорить о гидрофобных кластерах, где преиму­щественно локализованы гидрофобные аминокислотные остатки. Участки с малой локальной плотностью (гидрофобные кластеры) могут служить мягкой жидкоподобной прослойкой для относи­тельного смещения плотных упорядоченных структурных доменов. Для разных белков внутренний интерьер значительно варьирует и может иметь подвижную или более жесткую структуру.

Все внутримолекулярные движения в белках можно разбить на два типа: быстрые спонтанные флуктуации, происходящие за время меньше 10^-7 с, и медленные движения за время больше 10^-7 с.

Быстрая подвижность ( < 10^-7 с) имеет локальный характер внутри макромолекул. Для таких движений характерна зависи­мость  от размера атомных групп, что свидетельствует о наличии диффузионных процессов. Время ориентационной подвижности групп  обратно пропорционально коэффициенту вращательной диффузии . С увеличением размера группы  растет пропорци­онально кубу радиуса группы. Большинство быстрых движений проявляется на поверхности белковой молекулы; частично они вовлекают релаксацию связанной воды.

Для примера приведем времена релаксации некоторых атомных групп. Вращательная релаксация свободных молекул воды имеет 10^-11 – 10^-12 с; релаксация связанной воды — 10^-8 – 10^-9 с; вращательная релаксация боковых групп аминокислот — 10^-9 – 10^-10 с; равновесные конформационные перестройки на уровне со­седних аминокислотных остатков происходят в мили- и микросекундном интервале.

Медленные движения ( > 10^-7 с) требуют более масштабных изменений структуры и связаны с перемещением полипептидных цепей или доменов белковых молекул. Например, время жизни фермент-субстратных комплексов занимает интервал от 10^-2 до 10^-4 с.

Какова физическая природа флуктуации белковых молекул? В настоящее время обсуждаются различные модели динамической структуры белков. Не вызывает сомнений, что атомы в молекуле белка находятся в постоянном движении, и поэтому картина, наблюдаемая при рентгеноструктурном анализе, соответствует не­которой усредненной структуре. Тепловой энергии достаточно, чтобы обеспечить вращательные движения, которые обусловливают атомные флуктуации в молекуле белка. Наиболее быстрые локаль­ные перемещения за 10^-13 с связаны с вращением боковых групп вокруг одинарных связей в полипептидной цепи. Эти вращения (на угол от 20 до 60°) практически несогласованны и стерически огра­ничены соседними группами. Такие локальные перемещения бо­ковых групп напоминают броуновское движение в жидкости.

На протяжении более длительного времени (10^-12 – 10^-11 с) локальные хаотические движения сменяются скоординированны­ми перемещениями атомных групп. Величина таких движений может давать существенный вклад в суммарные амплитуды флук­туации атомов в молекуле белка, вызывая деформацию структуры белка как целого. Значительные смещения в плотно упакованной структуре белка возможны только в том случае, когда происходит кооперативное смещение соседних атомов. Наибольшие смещения (до 0,2 нм) атомных групп наблюдаются на поверхности белковой глобулы.

Динамическая модель позволяет понять роль небольших флук­туации в функции ферментов. Быстрые конформационные измене­ния необходимы в фермент-субстратных комплексах для простран­ственной подгонки функциональных групп в активном центре. На примере алкогольдегидрогеназы печени показано, что крупно­масштабным конформационным перестройкам, изменяющим функ­цию фермента, предшествуют высокочастотные мелкие флуктуации структуры. Алкогольдегидрогеназа состоит из четырех структур­ных доменов, между которыми расположен активный центр фер­мента. Доступность субстрата к активному центру регулируется вращением доменов вокруг шарнирного соединения.

С помощью рентгеноструктурного анализа было установлено, что алкогольдегидрогеназа может пребывать в двух конформациях: открытой, с большим зазором между доменами, и закрытой. После завершения химической реакции фермент принимает открытую конформацию и освобождается от продуктов реакции. Спонтанный переход между этими конформациями происходит за более дли­тельное время (10^-9 с), чем время локальных флуктуации (10^-12 с). Нужно допустить, что осуществление такого относительно мед­ленного крупномасштабного перемещения доменов в ферменте возможно только тогда, когда в результате небольших, достаточно быстрых локальных флуктуации происходит снижение к минимуму энергетического барьера вращения доменов.

Спектральные методы (дифференциальная спектрофотометр, флуоресцентная спектроскопия, ЯМР) являются конформационно-чувствительными и используются для изучения динамики и конформационных перестроек белков.