18-2.3-укр —протокол (1)

Тема заняття № 3. Дослідження регуляції ферментних процесів. Ензимопатії. Ензимодіагностика.

Цілі заняття:

• Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях.

• Аналізувати шляхи та механізми регуляції ферментативних процесів, як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях;

• Пояснювати зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при вроджених (спадкових) та набутих вадах метаболізму - ензимопатіях.

• Аналізувати зміни активності індикаторних ферментів плазми крові при патологіях певних органів та тканин.

Теоретичні питання:

1. Активація та інгібування ферментів.

• активатори ферментів;

• інгібування ферментів (зворотне, незворотне, конкурентне, неконкурентне).

2. Основні два принципи регуляції швидкості ферментативних реакцій:

   1. Регуляція шляхом зміни каталітичної активності ферментів.

• алостеричні ферменти;

• ковалентна модифікація ферментів;

• протеолітична активація ферментів (обмежений протеоліз);

• дія регуляторних білків;

• циклічні нуклеотиди в регуляції ферментативних процесів.

1. Регуляція шляхом зміни кількості ферментів.

• конститутивні та адаптивні ферменти.

3. Ізоферменти, множинні молекулярні форми ферментів.

4. Ензимодіагностика, ензимопатії та ензимотерапія.

5. Ізоферменти в ензимодіагностиці.

6. Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні (маркерні) показники розвитку патологічних процесів:

• інфаркт міокарду;

• захворювання печінки;

• захворювання м’язової тканини.

7. Природжені (спадкові) та набуті вади метаболізму, їх клініко-лабораторна діагностика.

8. Використання інгібіторів ферментів в якості лікарських засобів:

• ацетилсаліцилова кислота;

• алопуринол;

• сульфаніламідні препарати.

9. Ензимотерапія - використання ферментів в якості лікарських засобів

Практична робота

Завдання 1.Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази.

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

Зростання концентрації іонів Са²⁺ в нервовому закінченні є безпосереднім біохімічним сигналом, що активує вихід ацетилхоліну через пресинаптичну мембрану, його взаємодію з холінорецепторамипостсинаптичної мембрани та розщеплення медіатора в синоптичній щілині ацетилхолінестеразою. Тому іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що пішла на титрування є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Сироватка крові, мл	0,5	0,5	0,5
Розчин CaCl2, крапель	---	5	---
Розчин фосфаколу, крапель	---	---	5
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
Розчин ацетилхоліну –2%, мл	1,5	1,5	1,5
Інкубація 10 хвилин
Фенолфталеїн, крапель	2	2	2
Кількість 0,1М NaOH, що пішла на титрування

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне та практичне значення. Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічноїімпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишечника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібітори ацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки– ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.

Завдання 2. Дослідити вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини.

Принцип методу. Сполуки, що підвищують активність ферментів, називаються активаторами, а сполуки, що знижують активність ферментів – інгібіторами. До активаторів відносяться іони багатьох металів, зокрема: Na⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺ та ряд інших, а також органічні сполуки – проміжні продукти обміну речовин в організмі. Наприклад, жовчні кислоти є активатором ліпази, ацетил-КоА – активатором піруваткарбоксилази, тощо.

Інгібування ферментів поділяють на зворотне та незворотне. В свою чергу зворотне інгібування може бути конкурентним та неконкурентним.

Активатором амілази є хлорид натрію (NaCl), інгібітором – сульфат міді (CuSO₄). Показником впливу цих сполук на активність амілази є ступінь гідролізу крохмалю під дією ферменту в присутності NaCl та CuSO₄.

Хід роботи. Слину розводять в 2 рази. Беруть 3 пробірки. В пробірку №1 наливають 1мл води, в пробірку №2 – 0,8 мл води та 0,2мл 1% розчину NaCl, в пробірку № 3 – 0,8 мл води та 0,2мл 1% розчину CuSO₄. У всі три пробірки додають по 1мл слини. Вміст перемішують і додають по 2мл 1% розчину крохмалю, знову перемішують і ставлять в термостат чи на водяну баню при t=37°C на 15 хв.

Далі у всіх пробірках проводять реакцію з йодом. Спостерігають зміну забарвлення.

Результати роботи заносять у таблицю:

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Вода	1 мл	0,8 мл	0,8 мл
NaCl 1%	---	0,2 мл	---
CuSO4 1%	---	---	0,2 мл
Слина (розведення 1:2)	1 мл	1 мл	1мл
Крохмаль 1%	2 мл	2 мл	2 мл
Забарвлення після додавання йоду

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне та практичне значення. Інгібітори ферментів широко використовуються в медицині в якості лікарських засобів, зокрема ацетилсаліцилова кислота (аспірин)– інгібітор циклооксигенази (простагландин-синтази) використовується як протизапальний препарат, трисалол– інгібітор трипсину та контрикал– інгібітор протеїназ (зокрема калікреїнів) використовуються при панкреатиті, алопуринол – інгібітор ксантиноксидази застосовується при подагрі, тощо.

Українська й англійська термінологія заняття

Регуляція ферментів може бути швидкою (активація молекули ферменту) або повільною (регуляція синтезу ферменту в клітині).	The regulation of enzymes can be rapid (activation of the enzyme molecule) or slow (regulation of the enzyme synthesis in the cell).
Інгібітори – сполуки, що уповільнюють чи зупиняють хід ферментативних процесів.	Inhibitors - compounds that slow down or stop the enzymatic processes.
Конкурентні зворотні інгібітори за своєю будовою схожі на субстрат та взаємодіють з активним центром ферменту, збільшують Км, але не впливають на швидкість реакції. Прикладами таких інгібіторів є сульфаніламіди, велика кількість антибіотиків і протипухлинних препаратів.	Competitive inverse inhibitors are similar in structure to the substrate and interact with the active center of the enzyme, they increase Km, but do not affect the reaction rate. Examples of such inhibitors are sulfonamides, a large number of antibiotics and antitumor drugs.
Зворотні неконкурентні інгібітори взаємодіють з відмінними від активного центру ділянками молекули ферменту або з фермент-субстратним комплексом, не впливають на Км, але зменшують швидкість реакції. Прикладами таких інгібіторів є іони важких металів.	Reverse noncompetitive inhibitors interact with regions of the enzyme molecule or enzyme-substrate complex that are different from the active center, they do not affect Km but decrease the reaction rate. Examples of such inhibitors are heavy metal ions.
Незворотні інгібітори – руйнують одну чи декілька функціональних груп ферменту. Прикладами таких інгібіторів є алкілуючі агенти, що зв’язують SH-групи, і фосфорорганічні сполуки, що взаємодіють з ОН-групами ферменту.	Irreversible inhibitors - destroy one or more functional groups of the enzyme. Examples of such inhibitors are alkylating agents that bind SH-groups, and organophosphorus compounds that interact with the OH-groups of the enzyme.
Алостерична регуляція відбувається за рахунок активації регуляторної субодиниці ферменту, внаслідок чого змінюється активність каталітичної субодиниці. Більшість ферментів мають декілька каталітичних (C) і декілька регуляторних (R) субодиниць, наприклад, аспартаткарбамоїлтрансфераза – R6C6.	Alosteric regulation occurs due to activation of the regulatory subunit of the enzyme, which results in the activity of the catalytic subunit. Most enzymes have several catalytic (C) and several regulatory (R) subunits, for example, aspartate carbamoyltransferase - R6C6.
Ковалентна модифікація ферментів – спосіб зміни активності ферментів за рахунок приєднання (чи відділення) до молекули певних функціональних груп (фосфорилювання-дефосфорилювання, метилування, аденилування, АДФ-рибозилювання тощо).	Covalent modification of enzymes is a mode of changing the activity of enzymes by joining (or separating) of certain functional groups (phosphorylation-dephosphorylation, methylation, adenylation, ADP-ribosylation, etc.).
Протеолітична активація ферментів відбувається за рахунок відділення від неактивного попередника певної кількості амінокислотних залишків, внаслідок чого формується активний центр. Прикладами ферментів, що підлягають протеолітичній активації є пепсин, трипсин, хімотрипсин, фактори згортання крові.	The proteolytic activation of enzymes occurs due to separation from the inactive precursor of a certain amount of amino acid residues, resulting in the formation of an active center. Examples of enzymes subjected to proteolytic activation include pepsin, trypsin, chymotrypsin, blood coagulation factors.
Ензимопатії – це хвороби, що спричинені дефектом того чи іншого ферменту: фенілкетонурія – дефектом ферменту фенілаланілгідроксилаза, алкаптонурія – дефектом оксидази гомогентизинової кислоти, альбінізм – дефектом тирозинази, хвороба кленового сиропу (лейциноз) – дефектом дегідрогенази розгалужених α-кетокислот, галактоземія – дефектом ферменту галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза.	Enzymopathy is a disease caused by a defect of one or another enzyme: - phenylketonuria - a defect of the enzyme phenylalanylhydroxylase, - alpathonuria - a defect in the oxidase of homogentisic acid, - albinism - a deficiency tyrosinase, - maple syrup urine disease (leucinosis) - a defect of dehydrogenase of branched α-ketoacids, - galactosemia - defect of the enzyme galactose-1-phosphatidyltransferase.
В діагностиці захворювань органів і тканин найбільше значення має зростання активності певних ферментів у крові та інших біологічних рідинах: ЛДГ1, ЛДГ2, аспартатамінотранс-фераза (АсАТ), КФК – при інфаркті міокарду, ЛДГ4, ЛДГ5, аланінамінотрансфераза (АлАТ) – при інфекційних гепатитах і цирозі печінки, лужна фосфатаза – при захворюваннях кісткової тканини: рахіті, остеомаляції, хворобі Педжета, остеосаркомах та метастазах пухлин в кістках, кисла фосфатаза – при онкології передміхурової залози, γ-глутамінамінотрансфераза (ГГТ) – при захворюваннях печінки, жовчних проток, підшлункової залози.	In the diagnosis of diseases of organs and tissues, of greatest importance is the increase in the activity of certain enzymes in blood and other biological fluids: - LDH1, LDH2, aspartate aminotransferase (AsAT), KFK - in case of myocardial infarction, - LDH4, LDН5, alanine aminotransferase (AlAT) - in infectious hepatitis and liver cirrhosis, - alkaline phosphatase - in diseases of the bone tissue: rickets, osteomalacia, Paget's disease, osteosarcomas and metastases of the tumors in the bones, - acid phosphatase – at tumors of the prostate gland, - γ-glutaminaminotransferase (GGT) - in diseases of the liver, bile ducts, pancreas.

Рекомендована література.

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - 508 с.

2. Хмелевский Ю.В. Биологическая химия: Практикум. – К.: Вища школа., 1985. – 207 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. Під ред. Ю.В. Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

1. Маршалл В.Д. Клиническая биохимия. – М.: Бином-Диалект, 2011. – 408 с.

2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т.- М.: Мир, 1985.- 1056 с.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2 т. - М.: Мир, 1993. - т.1 - 381 с.; т.2 - 414 с.