Тема заняття: Дослідження ролі кофакторів та коферментів. Водорозчинні вітаміни. Дослідження біологічної ролі жиророзчинних вітамінів у метаболізмі та їх роль у реалізації клітинних функцій.

Цілі заняття:

• Трактувати роль вітамінів та їх біологічно активних форм в механізмах каталізу за участю основних класів ферментів.

• Пояснювати застосування антивітамінів як інгібіторів ферментів при інфекційних захворюваннях та при патологіях системи гомеостазу.

• Пояснювати роль металів в механізмах ферментативного каталізу.

• Класифікувати окремі групи коферментів за хімічною природою та типом реакції, яку вони каталізують.

• Трактувати біохімічні закономірності функціонування вітамінів як компонентів харчування людини та регуляторів ферментативних реакцій і обмінних процесів.

• Пояснювати біорегуляторні (гормоноподібні) та антиоксидантні функції жиророзчинних вітамінів А, Е, К, F, D.

• Аналізувати причини та молекулярно-біохімічні механізми виникнення патологій при гіпо- гіпервітамінозах.

Теоретичні питання

1. Загальна характеристика вітамінів як компонентів харчування людини.

2. Кофактори, коферменти та простетичні групи.

3. Роль іонів металів у функціонуванні ферментів.

4. Класифікація коферментів за хімічною природою та за типом реакції, яку вони каталізують.

5. Коферменти – переносники атомів водню та електронів (розглянути конкретні реакції):

• НАД⁺, НАДФ⁺ - коферменти – похідні вітаміну РР;

• ФАД, ФМН – коферменти – похідні вітаміну В₂ – рибофлавіну;

• роль вітаміну С в окисно-відновних реакціях.

6. Коферменти – переносники хімічних груп (розглянути конкретні реакції):

• піридоксалеві коферменти;

• НS-КоА – коензим ацилювання;

• ліпоєва кислота;

• уридиндифосфат, цитидинтрифосфат.

7. Коферменти ізомеризації, синтезу та розщеплення С–С зв’язків (розглянути конкретні реакції):

• тіаміндифосфат;

• карбоксибіотин – біологічно активна форма вітаміну Н – біотину;

• метилкобаламін та дезоксиаденозилкобаламін – похідні вітаміну В₁₂.

8. Жиророзчинні вітаміни(А, Е, К, F, D):

- біологічні властивості та роль в обміні речовин;

- прояви недостатності та гіпервітамінозу;

- джерела та добова потреба.

9. Біоантиоксидантні властивості жиророзчинних вітамінів.

10. Хвороби вітамінної недостатності:

- екзогенні гіпо- та авітамінози;

- ендогенні гіпо- та авітамінози;

- клініко-біохімічні аспекти авітамінозів.

Практична робота

Завдання 1. Визначення вмісту аскорбінової кислоти в сечі та плазмі крові як показник забезпеченості організму вітаміном С.

Для оцінки С-вітамінної забезпеченості організму найбільше поширення отримали прямі методи визначення аскорбінової кислоти в крові і сечі. Концентрація вітаміну в плазмі крові і виведення його з сечею знаходяться в тісному зв’язку і є показником забезпеченості харчового раціону вітаміном С.

Дослід 1. Визначення вітаміну С (аскорбінової кислоти) в сечі.

Принцип методу. Аскорбінова кислота в кислому середовищі відновлює молекулярний йод. Поява синього забарвлення вказує на те, що вся аскорбінова кислота з відновленої форми перейшла в окислену, і перша надлишкова крапля розчину йоду в присутності крохмалю дає синє забарвлення.

Хід роботи. В колбу відміряють 5мл сечі і додають 5 крапель розчину крохмалю. Титрують розчином йоду до появи синього забарвлення, що не зникає протягом 30 сек. Враховуючи, що 1мл розчину йоду відповідає 1 мкмоль аскорбінової кислоти, обчислюють виділення аскорбінової кислоти за добу за формулою:

Х = а  1  1500 / 5

де: а-кількість мл розчину йоду, що пішла на титрування;

1500 – добовий діурез;

5 – об’єм сечі в пробі;

Х – вміст аскорбінової кислоти в добовій кількості сечі.

В нормі за добу з сечею виділяється 284-568 мкмоль аскорбінової кислоти.

Дослід 2. Визначення вмісту аскорбінової кислоти в плазмі крові.

Принцип методу. Кількісне визначення вітаміну С грунтується на його здатності легко вступати у окисно-відновні реакції і відновлювати такі сполуки, як 2,6-дихлорфеноліндофенол (ДХФІФ). Розчин 2,6-ДХФІФ в нейтральному середовищі має синє забарвлення. Поки в розчині є аскорбінова кислота, 2,6-ДХФІФ відновлюється і при цьому знебарвлюється. Після окислення ним всієї аскорбінової кислоти надлишок реактиву забарвлює розчин в кислому середовищі в слабо рожевий колір.

Хід роботи. 5мл робочого розчину (який містить одну частину плазми крові, дві частини дист. води та дві частини 5% розчину метафосфорної кислоти) титрують розчином 2,6-ДХФІФ до появи рожевого забарвлення. Після чого титрування припиняють і відмічають кількість розчину 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування.

Розрахунок проводять за формулою:

Х = а  0,088  1000 / 1

де: а-кількість мл розчину 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування;

1000 – розрахунок на 1л;

0,088 – кількість мкмоль аскорбінової кислоти, що відповідає титру розчину 2,6-ДХФІФ;

Х – вміст аскорбінової кислоти в плазмі крові;

1 – кількість мл плазми, взятої для аналізу.

В нормі в плазмі крові міститься 34,1-90,9 мкмоль/л аскорбінової кислоти.

Клініко-діагностичне і практичне значення. Вітамін С (аскорбінова кислота) є необхідним харчовим фактором в організмі людини. Аскорбінова кислота бере участь в окислювально-відновних реакціях, синтезі стероїдних гормонів у корі наднирників і катехоламінів у мозковому шарі наднирників, у процесах гідроксилювання й посттрансляційної модифікації колагену, в утворенні тетрагірофолату з фолієвої кислоти; прискорює всмоктування заліза, активує пепсиноген.

Завдання 2. Виявлення жиророзчинних вітамінів.

Дослід 1. Виявлення вітаміну А. Реакція Друммонда.

Принцип методу. Сірчана кислота (H₂SO₄), яка має водовіднімаючі (дегідратаційні) властивості, сприяє перетворенню вітаміну A – ретинолу в забарвлений комплекс фіолетово-червоного кольору.

Хід роботи. В пробірку вносять 2 краплі риб’ячого жиру в хлороформі і 10 крапель концентрованої сірчаної кислоти (H₂SO₄). Спостерігають за появою забарвлення.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Вітамін А впливає на бар'єрну функцію шкіри, слизових оболонок, на проникність клітинних мембран і біосинтез їхніх компонентів, зокрема глікопротеїнів; бере участь в окислювально-відновних реакціях, оскільки здатний утворювати перекиси, які у свою чергу підвищують швидкість окислювання інших сполук.

При недостатності вітаміну А в людини з'являються симптоми гальмування росту, виснаження організму, специфічні ураження шкіри, слизових оболонок й очей. У першу чергу пошкоджується епітелій шкіри, що супроводжується його патологічним ороговінням. Наслідком цього порушення є поява вторинних гнійних і гнилісних процесів слизових оболонок усього шлунково-кишкового тракту, сечостатевої й дихальної системи. Специфічним для А-авітамінозу є ксерофтальмія - ураження очного яблука внаслідок закупорки сльозного каналу, епітелій якого також піддається ороговінню.

Дослід 2. Виявлення вітаміну Е. Реакція з азотною кислотою (HNO₃).

Принцип методу. Оскільки продукт окислення токоферолу має хіноїдну структуру, то при взаємодії спиртового розчину токоферолу з концентрованою азотною кислотою (HNO₃) реакційна суміш забарвлюється в червоний колір. Цю реакцію використовують для кількісного визначення вітаміну.

Хід роботи. В пробірку вносять 2 краплі 0,1% розчину α-токоферолу (вітаміну Е), додають декілька кришталиків сахарози і 1 краплю концентрованої азотної кислоти (HNO₃). Перемішують. Спостерігають за появленням забарвлення червоного кольору.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Вітамін Е (токоферол) є потужним і основним антиоксидантом. Його дія спрямована на посилення тканинного дихання і підтримання на постійному рівні вільно-радикального пероксидного окислення. Опосередковано як кофактор вітамін Е бере участь у транспорті електронів і протонів у дихальному ланцюзі, стимулює синтез убіхінону.

Токоферол служить "пасткою" для вільних радикалів - утворює із ними неактивні форми, які обривають вільно-радикальний ланцюг. Цим вітамін Е захищає від пероксидного окислення поліненасичені жирні кислоти в складі клітинних мембран. Гіповітаміноз супроводжується патологією мембран у вигляді пероксидного гемолізу еритроцитів, розсмоктування плоду під час вагітності, м'язової дистрофії, некрозу печінки, розм'якшення мозку, атрофії сім’янників, що приводить до безплідності.

Дослід 3. Виявлення вітаміну К. Реакція з лужним розчином цистеїну.

Принцип методу. При наявності цистеїну вікасол (вітамін К) в лужному середовищі забарвлюється в лимонно-жовтий колір.

Хід роботи. У пробірку вносять по 5 крапель розчинів вікасолу та цистеїну і 1мл 10% розчину їдкого натру (NaOH). Спостерігають за появою лимонно-жовтого забарвлення.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Цей вітамін є антигеморагічним фактором і має пряме відношення до згортання крові. Роль вітаміну К у згортанні крові зумовлена його участю в утворенні протромбіну, який є неактивним попередником ферменту тромбіну, що перетворює білок плазми крові фібриноген у фібрин. Фібрин є нерозчинним волокнистим білком, що приймає участь в утворенні кров’яного згустка. Для того, щоб протромбін міг активуватися і перетворитися на тромбін, він спершу повинен зв’язати іони Са²⁺. Нормальна молекула протромбіну містить декілька залишків особливої амінокислоти - -карбоксиглутамінової кислоти, яка й зв’язує іони Са²⁺. При нестачі вітаміну К місце залишків -карбоксиглутамінової кислоти займають залишки звичайної глутамінової кислоти. Відтак, порушується каскад згортання крові і, як наслідок, підвищується кровотеча.

ТЕРМІНОЛОГІЯ / TERMINOLOGY
Вітаміни – біоорганічні сполуки, що є життєво необхідними компонентами метаболізму, які не синтезуються в організмі людини, а надходять з компонентами харчування	Vitamins are bioorganic compounds, which are vital components of metabolism, which are not synthesized in the human body, but enter with food components
Водорозчинні вітаміни – гідрофільні вітаміни, безпосередньо беруть участь в обміні речовин як коферменти або складові компоненти коферментів. До них належать: тіамін (В1, антиневритний), рибофлавін (В2, вітамін росту), пантотенова кислота (В3, антидерматитний), нікотинамід (В5, антипелагричний), піридоксол (В6, антидерматитний), фолієва кислота (В9, антианемічний), цианкобаламін (В12, антианемічний), біотин (Н, антисеборейний), аскорбінова кислота (С, антискорбутний), біофлавоноїди, рутин (Р, капілярозміцнюючий)	Water-soluble vitamins - hydrophilic vitamins directly involved in metabolism as coenzymes or constituents of coenzymes. They include: thiamine (B1, anti-neuritis factor), riboflavin (B2, vitamin of growth), pantothenic acid (B3, anti-dermatitis factor), nicotinamide (B5, anti-pellagrous factor), pyridoxol (B6, anti-dermatitis factor), folic acid (B9, anti-anemic), cyanocobalamin (B12, anti-anemic), biotin (H, anti-seborrheic), ascorbic acid (C, anti-scorbutus, anti-scurvy, bioflavonoids, routine (P, capillary strengthening)
Жиророзчинні вітаміни – ліпофільні (гідрофобні) вітаміни, які не входять до складу ферментів та впливають на обмін речовин опосередковано. До них належать: ретинол (А, антиксерофтальмічний), кальциферол (D, антирахітний), токоферол (Е, антиоксидант, вітамін розмноження), нафтохінон (К, антигеморагічний), поліненасичені ВЖК (F, антисклеротичний)	Fat-soluble vitamins are lipophilic (hydrophobic) vitamins that are not the part of the enzymes and have an indirect effect on the metabolism. They include: retinol (A, anti-xerophthalmic), calciferol (D, anti-rachitic, antistiffness factor), tocopherol (E, antioxidant, reproduction vitamin), naphthoquinone (K, anti-hemorrhagic), polyunsaturated НFA or LChFA (F, anti-sclerotic)
Провітаміни – речовини екзогенного походження, з яких в організмі під дією певних ферментів утворюються вітаміни	Provitamins are substances of exogenous origin, in the body vitamins are formed from them under the action of certain enzymes
Антивітаміни – речовини, вживання яких зумовлює появу ознак вітамінної недостатності	Antivitamins are substances, the use of which leads to the emergence of vitamin deficiency signs
Вітаміноподібні речовини – біологічно активні низькомолекулярні органічні сполуки, які синтезуються в організмі у малих концентраціях та беруть участь каталітичних та інших процесах. До них належать: убіхінон, інозітол, карнітин, холін, ліпоєва кислота, оротова кислота, пангамова кислота, параамінобензойна кислота	Vitamin-like substances are biologically active low molecular weight organic compounds, which are synthesized in the body at low concentrations and are involved in catalytic and other processes. They include: ubiquinone, inositol, carnitine, choline, lipoic acid, orotic acid, pangamic acid, para-aminobenzoic acid
Вітамінна недостатність виникає у разі недостатнього надходження в організм вітамінів або порушення їх всмоктування та метаболізму, що призводить до виникнення певних клінічних ознак	Vitamin deficiency occurs in the case of inadequate vitamin intake or violation of their absorption and metabolism, which leads to the emergence of certain clinical signs
Авітамінози – стани організму людини, що виникають у разі глибокої нестачі вітаміну, проявляються яскраво вираженою клінічною картиною, можуть мати фатальні наслідки	Avitaminosis is the human body state that arises in the case of a deep deficiency of vitamin, it is manifested in a pronounced clinical picture, may have fatal consequences
Гіповітамінози – стани організму людини, що виникають за відносної нестачі вітаміну, мають помірно виражену клінічну картину	Hypovitaminosis is the human body state arising at the relative lack of vitamin, it has a moderately pronounced clinical picture
Гіпервітамінози – стани організму людини, що виникають за надмірного надходження та накопичення вітамінів в організмі людини, характеризується специфічними для кожного вітаміну проявами. Хронічний гіпервітаміноз характерний для жиророзчинних вітамінів	Hypervitaminosis is the human body state arising at the excessive intake and accumulation of vitamin in the human body; it is characterized by vitamin-specific manifestations. Chronic hypervitaminosis is characteristic for fat-soluble vitamins