Работа №1

Клеточная культура как объект исследования в биохимии. Подходы к устройству культуральной лаборатории. Техника безопасности.

Приборы, посуда и расходные материалы, используемые при культивировании адгезионных и суспензионных культур клеток.

Введение

Зачем и кому нужны клеточные культуры ? Культуры клеток животных в настоящее время – это и метод и объект исследования одновременно, используемые в различных областях биологии и медицины. Используют их при решении таких задач, как выяснение механизмов дифференцировки и пролиферации, путей меж- и внутриклеточного сигналинга, взаимодействия клеток со средой и субстратом, адаптации к различным факторам окружающей среды, старения, злокачественной опухолевой трансформации и многое другое. Помимо этих общебиологических фундаментальных задач, клеточные культуры играют важную роль в биотехнологии при производстве вакцин, биологически активных веществ. На культурах клеток тестируют новые медикаментозные препараты. Использование клеток in vitro расширяет возможности оценки не только морфологических и биохимических изменений, но также изменений в поведении клеток, их реакций на различные агенты, в том числе на лекарственные воздействия. В биохимии использование культур клеток удобно тем, что при правильном подходе к постановке культуры исследователь получает быстро воспроизводимый, синхронный и однородный объект исследования, позволяющий резко повысить «чистоту» изучаемого ответа на какое либо воздействие. Только в клеточной культуре можно наблюдать напрямую биохимическую жизнь клеток, не делая поправку на нейрогуморальную регуляцию метаболизма, как это необходимо делать при работах на биологических тканях.

Разумеется, работа с клетками, растущими вне организма, требует определенных навыков. Спрос на клеточные технологии в областях как научно-иследовательского профиля, так и медико-биотехнологической индустрии обуславливает потребность в подготовке специалистов-биохимиков владеющих навыками работы с клеточными культурами.

Клетки животных in vitro

Культура клеток - метод, позволяющий сохранять жизнеспособность клетки и выращивать клетки животного, включая человека, вне организма (in vitro) на/в питательной среде.

Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, исторически потребовалось овладеть рядом методик:

• Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов.

• Методики разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется.

• Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.

• Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.

Историческая справка Основные вехи развития методологии культивирования клеток

1885 - Ру (Roux) показал, что клетки куриного эмбриона сохраняют жизнеспособность в солевом растворе вне тела животного.

1907 - Xаррисон (Harrison) культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Он пытался показать, что аксоны образуются в виде выростов отдельных нервных клеток.

1909 – А. Максимовский (Россия) постулировал существование стволовой кроветворной клетки. На заседании Общества Гематологов в Берлине 1 июня 1909 года он ввёл понятие «Stammzelle», подразумевая под этим определением лимфоцит в более широком значении этого слова, как клетку, способную быть стволовой в современном понимании этого слова

1910 - Раус (Raus) индуцировал опухоль, использовав профильтрованный экстракт куриной опухоли, содержащий, как было установлено позже, РНК-вирус (вирус саркомы Рауса).

1913 - Каррель (Carrel) доказал, что в асептических условиях клетки могут расти в культуре в течение длительного времени, если их обеспечить необходимыми питательными веществами.

1948 - Эрл (Earle) и сотрудники установили, что одиночные клетки клеточной линии L в культуре ткани формируют клоны клеток.

1952 - Джей (Gey) и сотрудники получили перевиваемую клеточную линию из карциномы шейки матки; эта клеточная линия широко известна как линия клеток HeLa.

1954 - Леви-Монтальчини (Levi-Montalcini) и сотрудники показали, что в культуре тканей фактор, стимулирующий рост нейронов, вызывает рост аксонов.

1955 - Игл (Eagle) впервые систематически исследовал пищевые потребности клеток в условиях культуры тканей и обнаружил, что клетки животных способны существовать в определенной смеси низкомолекулярных веществ, дополненной не-большим количеством белков сыворотки.

1956 - Пак (Puck) и сотрудники отобрали из культуры клеток HeLa мутантов, потребности которых для роста в культуре резко отличались от потребностей обычных клеток.

1958 - Темин и Рубин (Temin, Rubin) разработали количественный тест инфицирования клеток цыпленка в культуре очищенным вирусом саркомы Рауса. В течение следующего десятилетия Стокер, Дульбекко, Грин (Stoker, Dulbecco, Green) и другие вирусологи установили характеристики вирусной трансформации различных типов.

1961 - Хайфлик и Мурхэд (Hayflick, Moorhead) показали, что в культуре фибробласты человека погибают после определенного числа делений.

1964 - Литтлфилд (Littlefield) впервые использовал для выращивания гибридов соматических клеток селективную среду НАТ. Это нововведение в сочетании с методом гибридизации клеток позволило приступить к изучению генетики соматических клеток.

1964 - Като и Такеуши (Kato, Takeuchi) получили целое растение моркови из растущей в культуре ткани одиночной клетки корня моркови.

1965 - Хэм (Ham) предложил бессывороточную среду определенного химического состава. которая способна поддерживать рост клонов некоторых клеток животных.

1965 - Харрис и Уоткинс (Harris, Watkins) индуцировали вирусом слияние клеток мыши и человека и получили первые гетерокарионы клеток млекопитающих.

1968 - Августи-Точчо и Сато (Augusti-Tocco, Sato) адаптировали к условиям культуры клеток опухоль нервных клеток мыши (нейробластому) и выделили клоны, которые реагировали на раздражение электрическим током и разрастались в нервные волокна. Одновременно получено большое количество других дифференцированных клеточных линий, включая линии скелетных мышц и печени.

1975 - Кёлер и Мильштеин (Kohler, Milstein) получили первые клеточные линии гибридом, секретирующих моноклональные антитела.

1976 - Сато (Sato) и сотрудники опубликовали первую серию статей, в которых было показано, что для роста в бессывороточной среде различным клеточным линиям необходимы различные смеси гормонов и факторов роста.

1981 - Мартин Эванс (Англия) впервые выделил недифференцированные плюрипотентные линии стволовых клеток, полученные из бластоцисты мыши.

1998 - Д. Томпсон и Д. Герхарт выявили бессмертную линию эмбриональных стволовых клеток (ЭСК).

1999 - журнал Science признал открытие эмбриональных стволовых клеток третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном человека».

2006-2008 – Осаму Симомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсьен открывают и изучают зелёный флуоресцентный белок (GFP)». Разработан метод введения гена GFP в определенные гены животных клеток, позволяющий сделать флуоресцентными собственные белки клетки. Таким образом, дав возможность высококачественного и очень специфического мечения и прижизненного наблюдения за структурными элементами клетки.

2012 - Джон Гёрдон и Синъя Яманака показали возможность перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные.