2. Материал и методы исследования

1. Материал исследования

Объектом исследования были медицинские пиявки. Животных приобретали в аптеке (ул. М. Расковой г. Саранска) и содержали при комнатной температуре в чистой воде в прохладном месте в прозрачной фаянсовой) посуде, плотно завязанной полотном. Полезно положить в воду немного конского волоса, о который животные могут счищать слизь. Для содержания 10 червей требуется не менее литра воды. Через каждые 2—4 дня воду меняли, а посуду тщательно мыли. Пиявки способны голодать долгое время. Однако при длительном содержании их необходимо подкармливать сгустками свежей крови (полученной с бойни) или подсаживать к ним на время живую лягушку.

Материалом исследования служила цепочка нервных ганглиев, полученная путем препарирования пиявки.

2. Методы исследования

1. Приготовление препаратов. Растворы и реактивы

Используемые препараты представляли собой цепочки нервных ганглиев медицинской пиявки. Животное анестезировали с помощью 10%–го раствора этанола. Для выделения ганглиев пиявку вскрывали с брюшной стороны и очищали выбранный ганглий от сосудистой оболочки. Все операции проводились в растворе Рингера для беспозвоночных (NaCl 115 мМ, KCl 4 мМ, CaCl₂ 1,8 мМ, MgCl₂ 1 мМ, HEPES 10 мМ; рН 7,4; 20⁰C). Эксперименты проводились при комнатной температуре (20⁰С). Отпрепарированную цепочку ганглиев фиксировали на предметном стекле вентральной стороной вверх и накрывали покровным стеклом для проведения оптической и флуоресцентной микроскопии. Так же помещали в водный раствор Ф, затем отмывали в растворе Рингера и определяли уровень флуоресценции на системе визуализации IVIS^® LuminaII.

2.2.2 Приготовление раствора хтц и ф

Для получения флуоресцентного изображения нервной цепочки нами было приготовлено два раствора флуоресцентных зонда, ХТЦ и Ф. Приготовили 30 миллилитров раствора Ф с концентрацией 1мМ,

V=0,03литра; Mr_{(флуоресцеина)}=332,306г/моль; С=0,001; по формуле (1)

(1)

Где C– молярная концентрация, моль/л;

m – масса навески, г;

Mr­ – молекулярная масса;

V – обьем, л;

, m=0,001г.

Приготовили 50 мл. раствора ХТЦ (Mr=478,88), с концентрацией 0,001. Для этого навеску массой 0,024г. Растворили в воде. Расчет по формуле (1)

2.2.3 Флуоресцентная спектроскопия

Для успешного применения флуоресцентных методов необходимо хоро­шее знание аппаратуры и умение обращать внимание на детали эксперимен­та. Для этого существуют две причины. Во-первых, флуоресценция — очень чувствительный метод. Почти всегда можно получать наблюдаемые сигналы, увеличив коэффициент усиления приборов. Однако эти сигналы могут быть обусловлены не только используемым флуорофором: наблюдаются сигналы фоновой флуоресценции растворителей, просачиваю­щегося в прибор света, побочное рассеяние света от мутных растворов, рэлеевское или/и комбинационное рассеяние (названы лишь некоторые из помех). Во-вторых, идеальных спектрофлуориметров не существует. Из-за неоднородного спектрального состава источников света и зависимости чув­ствительности монохроматоров и фотоумножителей от длины волны на при­борах нельзя получить истинных спектров возбуждения и испускания. На измерения интенсивностей флуоресценции могут влиять также поляриза­ция и анизотропия испускаемого света. Поэтому для получения надежных спектральных данных надо постоянно осуществлять контроль за многочис­ленными факторами.

Флуоресцентная спектроскопия - весьма чувствительный метод анализа химического состава образца, позволяющий обнаруживать следовые количества веществ и даже их отдельные молекулы. В качестве источников возбуждающего излучения особенно эффективны лазеры.

Существует ряд чувствительных методов, позволяющих регистрировать изменения, происходящие в исследуемых образцах под действием света. К ним, в частности, относятся индуцированная лазером флуоресценция, лазерная фотоионизация и фотодиссоциация. Оптико-акустический преобразователь измеряет поглощение модулированного света по интенсивности возникающей звуковой волны. Фотогальванические элементы контролируют ток в газовом разряде при исследовании заселенностей высоколежащих уровней, селективно возбуждаемых перестраиваемым лазером.

Изучение флуоресценции обычно производится при помощи перестраиваемых лазеров непрерывного излучения. Перестраиваемость лазеров на красителях или лазеров на титан-сапфире с удвоением частоты расширяет экспериментальные возможности изучения непрерывной флуоресценции. Для изучения широкополосной флуоресценции в твердых и жидких образцах обычно удобны ширины линий от2 до 400 ГГц [27].