Родамин с
Он относится к группе аминоксантеновых красителей. Широко применяется в аналитической химии. Кристаллический порошок серовато–коричневого цвета с зеленым отливом. Хорошо растворим в этаноле, хлороформе, ацетоне, диметилформамиде, воде. Люминесценция в твердом состоянии – бордовая, в растворе – оранжево–розовая [12].
Рисунок 4– Химическая структура зонда родамин С
Красители родаминового ряда снискали широкое применение в качестве олигонуклеотидных меток. В отличие от производных флуоресцеинов, их спектральные характеристики не меняются в диапазоне рН от 4 до 10. Родамины интенсивно поглощают в видимой и менее интенсивно в ультрафиолетовой части спектра. Поэтому для возбуждения их флуоресценции можно применять как видимый, так и ультрафиолетовый свет. Эти соединения характеризуются молекулярным типом свечения, спектры поглощения и флуоресценции зеркально–симметричны [13]. Основные флуоресцентные характеристики представлены в таблице 2.
Таблица 3 – Основные флуоресцентные характеристики родамина С
MW: |
457.52 |
Поглощение: λмакс. |
524 нм |
Флуоресценция: λмакс. |
557 нм |
Молярный коэффициент поглощения при λмакс. |
108,000 M–1*см–1 |
Квантовый выход |
~ 0.75 |
1.2 Общая характеристика медицинской пиявки
Пиявка медицинская (лат. Hirudo medicinalis) – вид кольчатых червей подкласса пиявок, применяемый в Европе с медицинскими целями.
Паразит, питающийся кровью человека и животных, полезные свойства которого известны людям с древнейших времён. В диком виде встречается в Европе практически повсеместно, хотя численность во многих регионах многократно сократилась из–за промышленного вылова в прошлом, осушения болот и загрязнения воды.
Имеет округлое сплющенное тело с двумя присосками на заднем и переднем конце, в центре передней присоски расположено ротовое отверстие. Подстерегает жертву сидя в воде, прикрепившись к тростнику или корягам. За одно кормление пиявка может высосать крови в 6 раз больше своего веса. Высосанная кровь сохраняется в желудке в жидком состоянии месяцами, не сворачиваясь, а жить от кормления до кормления пиявка может до двух лет [18].
1.2.1 Нервная система медицинской пиявки
Со времен Древней Греции и Рима пиявки использовались врачами для лечения больных, страдающих такими заболеваниями, как эпилепсия, стенокардия, туберкулез, менингит и геморрой — довольно неприятное лечение, которое почти всегда приносило больше вреда, нежели пользы несчастным жертвам. К XIX веку использование медицинских пиявок приняло такой масштаб, что они практически исчезли в Западной Европе. Поэтому Наполеон был вынужден импортировать около 6 миллионов пиявок в год из Венгрии для лечения своих солдат. Эта «мания» гирудотерапии принесла свои определенные плоды: использование пиявок в медицине способствовало изучению их размножения, развития и анатомии. В конце XIX века основатели экспериментальной эмбриологии, такие как, например, Уитман, выбрали именно пиявку для того, чтобы проследить судьбу ранних эмбриональных клеток. Аналогичным образом их нервная система (НС) была тщательно изучена плеядой выдающихся анатомов, включая Рамон–и–Кахаля, Санчеса. Гаскелла, Дель Рио Хортега, Одури и Ретциуса. Затем интерес к пиявкам упал и вновь появился в 1960 году, когда Стивен Куффлер и Давид Поттер впервые применили современные нейрофизиологические методики для изучения свойств ее НС. Это способствовало началу интенсивного изучения ее развития, биофизики и молекулярной биологии, нервных связей и поведения [19].
Тело и НС пиявки сегментировано и состоит из большого числа стереотипных повторяющихся единиц (сегментов), которые имеют сходное строение. Каждый сегмент иннервируется стереотипно устроенным ганглием, все ганглии имеют близкое строение. Даже специализированный головной и хвостовой «мозг» состоит из слившихся ганглиев, и в нем легко прослеживаются многие свойства, характерные для сегментарного ганглия.
Каждый ганглий состоит примерно из 400 нейронов, которые имеют определенную форму, размер, расположение и ветвление (branching pattern). Ганглий иннервирует определенную зону тела посредством парных нервов, а также соединяется с соседними и удаленными частями НС посредством дополнительных пучков волокон (коннектив). Интеграция информации осуществляется последовательно на следующих хорошо различимых этапах [20].
Нервная система пиявки представляет собой цепочку ганглиев. Церебральные ганглии помещаются в шестом сегменте над глоткой. Далее следуют большая передняя ганглиозная масса брюшной нервной цепочки, 21 простой ганглий цепочки и большая задняя ганглиозная масса (рисунок 5,6). Принципиальные особенности его заключаются в следующем:
(А) ЦНС пиявки представлена цепочкой из 21 сегментарного ганглия, головного и хвостового ганглия («мозг»). Каждый сегмент тела образован пятью круговыми кольцами; центральное кольцо содержит нервные окончания сенсорных органов, чувствительных к свету и прикосновению (сенсиллы). (В) Нервная цепочка находится в вентральной части тела, в брюшной лакуне. Ганглии, соединенные друг с другом пучками аксонов (коннектив). парными корешками иннервируют стенку тела. Мышцы образуют три основных слоя: циркулярный, косой и продольный. Кроме того, имеются дорзовентральные мышцы, сокращение которых уплощает пиявку, а также мышечные волокна непосредственно под кожей, образующие при сокращении складки.
Рисунок 5 – ЦНС пиявки
1) Коннективы состоят из двух тяжей аксонов и соединяют между собой соседние ганглии. Каждый коннектив содержит несколько тысяч немиелинизированных аксонов, диаметр которых менее 4 мкм. Третье, более тонкое волокно, Файвровский нерв, лежит между коннективами [21].
2) С каждой стороны ганглия располагаются передние и задние корешки. Аксоны, выходящие из корешков, иннервируют стенку тела и прилегающие внутренние органы. Большая часть нервов 5–го и 6–го ганглиев иннервирует репродуктивные органы.
3) Капсула соединительной ткани, содержащая рассеянные волокна гладкой мускулатуры. Она окружает всю ЦНС и покрыта слоем эндотелиальных клеток. In situ, НС располагается в кровяном синусе; весь обмен между кровью и нейронами или глиальными клетками осуществляется путем диффузии через капсулу, поскольку в самой ЦНС капилляры отсутствуют.
4) По оценкам [22] каждый ганглий содержит приблизительно 350 клеток. В нескольких ганглиях с обеих сторон нервной цепочки число клеток больше. Клетки объединены в 6 отдельных групп, или «пакетов», каждый из которых ассоциирован с одной большой глиальной клеткой. Границы пакетов являются удобными метками, которые помогают распознавать индивидуальные нейроны. Расположение клеток относительно постоянно, так что около 30 нейронов на вентральной поверхности ганглия могут быть безошибочно идентифицированы. Среди них – две гигантские Retzius–клетки, T, P и N – нейроны. Нейроны униполярные; синаптические контакты образуются в области центрального нейропиля. Синапсы на телах клеток отсутствуют.
5) Глиальные клетки. Одиночная глиальная клетка занимает пространство между телами нейронов в пакете. Две гигантские глиальные клетки ассоциированы с нейропилем и по одной с каждым коннективом. Пространство между нейрональной и глиальной мембранами (150 А) служит каналом для перемещения ионов и небольших молекул.
Рисунок 6 – Сегментальный ганглий ЦНС медицинской пиявки (вентральная сторона). Отмечены механочувствительные нейроны и их типичный ответ на действие адекватного стимула [23].