1. Флуоресцеин

Флуоресцеин (Ф) – жёлтые кристаллы, плохо растворимые в воде, лучше – в спирте и водных щелочах, обладает сильной жёлто–зелёной флуоресценцией (отсюда и название) [12].

Рисунок 1 – Флуоресцеин – общий вид и химическая структура

Ф относится к группе триарилметановых (ксантеновых) красителей, Ф используют для изучения путей следования подземных вод, его динатриевую соль (уранин) – как компонент флуоресцирующих составов, изотиоцианатные производные Ф – в качестве биологических красок для определения антигенов и антител. Практическое значение имеют также некоторые галогензамещённые Ф, например эозины. Получают Ф конденсацией фталевого ангидрида с резорцином. Основные его флуоресцентные характеристики представлены в таблице 1.

Таблица1 Основные флуоресцентные характеристики флуоресцеина

MW:	376.3
Поглощение: λмакс.	492 нм
Флуоресценция: λмакс.	520 нм
Молярный коэффициент поглощения при λмакс.	83,000 M–1*см–1
Квантовый выход	~ 0.8

Производные флуоресцеина являются наиболее распространенными флуоресцентными метками, вводимыми в олигонуклеотиды. Карбоксифлуоресцеин имеет достаточно большой молярный коэффициент поглощения и высокий квантовый выход. Кроме того, максимум возбуждения для производных флуоресцеина находится в диапазоне спектральных линий аргонового (488 нм) и Nd:YAG (477 нм) лазеров, что делает этот краситель незаменимым в таких областях, как:

• ДНК анализ с лазер–индуцируемой флуоресцентной детекцией;

• микроскопия с конфокальным лазерным сканированием;

• проточная цитофлуориметрия.

Тем не менее, при работе с производными флуоресцеина и их конъюгатами следует учитывать их следующие особенности:

• относительно высокая скорость выцветания;

• рН–чувствительная флуоресценция (рКа ~ 6.4), которая существенно уменьшается при рН ниже 7.0;

• относительно широкий спектр флуоресценции, ограничивающий использование производных флуоресцеина в некоторых приложениях, предусматривающих использование нескольких флуоресцентных красителей одновременно;

• возможное уменьшение интенсивности флуоресценции в составе конъюгатов с биополимерами, особенно при множественном замещении [13].

2. Хлортетрациклин

Хлортетрациклин (ХТЦ) – антибиотик группы тетрациклинов. Кристаллический порошок золотисто–желтого цвета, горького вкуса, растворим в воде. Растворимость основания в воде до 0,6 мг (при температуре 25°С), ХТЦ гидрохлорида – 13 мг/мл (при 18°С). Антибиотик наиболее активен в кислой среде (рН 3,0–4,0), в щелочной разрушается [12].

Рисунок 2 – Химическая структура хлортетрациклина

ХТЦ нашел широкое распространение в качестве зонда на кальций. С его помощью изучают распределение ионов кальция в клетке и в различных органах, а также его изменение в процессе жизнедеятельности организма. Он образует сложный комплекс с ионами кальция, связанными биомембранами, который флуоресцирует тем интенсивнее, чем больше кальция адсорбировано на биомембранах [14].

Максимум его поглощения 380–400 нм, максимум флуоресценции 520–530 нм). При рН<7 молекула ХТЦ, по–видимому, не несет заряда, но при увеличении рН она ионизуется, что сопровождается ростом флуоресценции. В области рН=6 и выше молекула ХТЦ может присоединять один ион Mg²⁺или два иона Са²⁺. Даже в водном растворе связывание катионов сопровождается увеличением квантового выхода флуоресценции ХТЦ. Дальнейший рост флуоресценции наблюдается при попадании катион–ХТЦ комплекса в гидрофобное окружение [15].

В неполярной фазе сродство зонда к ионам кальция выше, чем к ионам магния. В присутствии кальция возрастает сродство ХТЦ к мембране и квантовый выход флуоресценции комплекса ХТЦ с мембраной (в 200 – 400 раз). Увеличение квантового выхода происходит, возможно, благодаря тому, что погруженная в мембрану молекула зонда (или часть молекулы) становится недоступной для воды и ее тушащего действия. Сдвиг спектров ХТЦ свидетельствует о погружении этого красителя в более гидрофобную область при связывании. В присутствии кальция ХТЦ практически полностью связан с мембраной [16].

2. Пирен

Пирен  — химическое соединение с формулой C₁₆H₁₀, полициклический ароматический углеводород. Белое кристаллическое вещество. При длительном хранении окрашивается в желтоватый цвет за счет образования продуктов окисления [17].

Рисунок 3 – Строение молекулы пирена

Пирен – гидрофобный флуоресцентный зонд, способный встраиваться в неполярные области между жирнокислотными цепями фосфолипидов бислоя мембран. При этом в спектре флуоресценции пирена, встроенного в мембрану, обнаруживаются 3 пика ( в области 370 – 390 нм), характерные для мономерной формы пирена, и один пик ( в области 460 – 470 нм), характерный для эксимера пирена – димера (таблица 2).

Растворяется в этаноле, диэтиловом эфире, бензоле, CHCl₃, CS₂, не растворяется в воде. В растворе флуоресцирует голубым цветом. Будучи сближены в пространстве, производные пиренов формируют эксимер. При этом пик флуоресценции эксимера отличен от пика флуоресценции одиночного красителя (470нм – эксимер, 376нм – пирен). Это свойство пиренов активно используют для проведения структурных исследований нуклеиновых кислот [13].

Таблица 2 – Основные флуоресцентные характеристики пирена

MW:	385.42
Поглощение: λмакс.	340 нм
Флуоресценция: λмакс.	376 нм
Молярный коэффициент поглощения при λмакс.	43,000 M–1*см–1