1.1.1 Метод флуоресцентных зондов

Есть много биологически важных соединений, которые сами не люминесцируют и поэтому использовать весьма чувствительные, неразрушающие вещество и хорошо отработанные методы люминесцентного анализа для их изучения напрямую невозможно. Поэтому в настоящее время при изучении биообъектов наряду с исследованием собственной флуоресценции клеток и тканей широко используется метод флуоресцентных зондов. Суть этого метода заключается в следующем: существует ряд люминесцирующих веществ (зондов), которые избирательно взаимодействуют с определенными компонентами клетки и отдельными молекулами, причем образующийся комплекс флуоресцентного зонда и взаимодействующего с ним вещества клетки, как правило, имеет более интенсивную флуоресценцию, чем люминесцентный зонд в несвязанном состоянии. Свечение этого комплекса под действием света называют вторичной (наведенной) или зондовой флуоресценцией [7].

Он является одним из наиболее эффективных дополнительных методов контроля гомеостаза живых систем. Флуоресценция – это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Спектр испускания вещества представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждения света [8].

Флуоресцентные методы позволяют просто и экономично решить многие задачи клинической диагностики, экологического контроля и физико–химического анализа и все шире применяются в медицинских и биохимических исследованиях [9].

Люминесцентные измерения являются хоть и относительными, но прямыми измерениями: детектируется только интенсивность излучения образца, немедленно дающая спектральные характеристики. Однако в данном методе не используется опорный образец, а значит необходимо вводить корректировку на дисперсионные потери в аппаратуре, что сделать очень сложно. Вследствие этого флуоресцентным данным присущи большие ошибки как в отношении длины волны (± 5 нм), так и интенсивности люминесценции (± 10%). Несмотря на это, по сравнению с абсорбционной спектроскопией флуориметрия более информативна в отношении фотофизики молекул. В то время как в абсорбционной спектроскопии единственным измеряемым параметром является поглощение А (λ), флуоресцентная спектроскопия позволяет получить ряд независимых параметров, таких как квантовый выход (также называемый иногда квантовой эффективностью) Ф, расстояние безызлучательного переноса энергии Rc, время жизни t, поляризация р или анизотропия r, Стоксов сдвиг М и много других, каждый из которых дает определенную информацию о системе [1].

1. Флуоресцентные зонды, используемые в биологии и медицине

Исследование собственной флуоресценции биологических материалов не всегда позволяет получить желаемую информацию об объекте. В таком случае используют искусственные флуорофоры, т. е. специально синтезированные вещества, имеющие специфический спектр флуоресценции либо в свободном состоянии, либо при связывании с тем или иным объектом исследования. Флуоресценция таких веществ (зондов), как правило, обладает высоким квантовым выходом и достаточно большим временем жизни.

С помощью флуоресцентных зондов можно исследовать молекулярные механизмы возникновения и развития патологических процессов, действие на организм биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Флуоресцентные зонды применяются также для диагностики и прогноза развития заболеваний, выявления факторов риска и контроля эффективности лечения. Зондовая флуоресценция чувствительна к структурно–функциональным изменениям в биологических мембранах, микровязкости ее липидного бислоя, связыванию с белками и другими веществами, структурным перестройкам в белках, изменению мембранного потенциала и концентрации внутриклеточного кальция и др. Анализируя спектр флуоресценции клеток и мембран, связанных с зондом, можно определить полярность микроокружения флуорофора. Интенсивность и время жизни флуоресценции зонда характеризуют подвижность сольватной оболочки, поляризация флуоресценции – вращательную подвижность, ориентацию и вязкость микроокружения зонда. Тушение флуоресценции зонда посторонними веществами позволяет установить доступность флуорофора для тушителя, его локализацию в белках и мембранах клеток и их проницаемость для тушителей, скорость диффузии. По переносу энергии возбуждения с мембранных белков на флуоресцентный зонд и по степени эксимеризации зонда можно определить расстояние между флуорофорами и вязкость среды, окружающей зонд [10].

Одним из важнейших звеньев в молекулярном механизме действия на организм биологически активных соединений является мембрана. С помощью мембранных зондов можно определить сродство лиганда к мембране, скорость проникновения через нее и его локализацию в клетках и тканях, выяснить связь проницаемости лиганда с его активностью, изучить его действие на структуру и физико–химические свойства мембраны и др. К мембранным зондам относятся такие вещества, как пирен, перилен, 4–(n–диметиламиностирил)–N–метилпиридиния (ДСМ), n–толуолсульфонат 4–(n–диметиламиностирил)–1–гексилпиридиния (ДСП) и т. д. Такие зонды позволяют непосредственно наблюдать за процессом проникновения веществ через мембрану, встраиваясь в нее и меняя свою флуоресценцию под действием различных факторов и соединений.

В настоящее время известно более ста различных флуоресцентных зондов, специфически связывающихся с определенными биомолекулами и клеточными субструктурами [11].