Введение

Флуоресцентный анализ – совокупность методов качественного и количественного анализа, основанных на флуоресценции исследуемого вещества. Качественный анализ осуществляют по цвету флуоресцентного излучения, количественный – по интенсивности последнего.

Флуоресцентные методы нашли широкое применение в биологических исследованиях. Для измерения различных межклеточных параметров, таких как выброс кальция, изменение рН и потенциала мембраны сейчас используют флуоресцентные зонды – молекулы, способные при поглощении кванта света оптического диапазона испускать новый квант света. В целом, эти зонды чрезвычайно чувствительны и способны обнаруживать более тонкие изменения клетки, тем самым снижая необходимость использовать смерть клетки в качестве конечной точки.

Методы исследования флуоресценции конкретных веществ обладают высокой чувствительностью, а также удобным временным диапазоном, так как испускание флуоресценции происходит через 10^–8 с (10 нс.) после поглощения света. За это время происходит множество различных молекулярных процессов, которые влияют на спектральные характеристики флуоресцирующего соединения. В настоящее время созданы приборы, позволяющие измерять флуоресценцию 10^–18 с зонда в живой клетке за время около 10^–5 с, что намного превосходит чувствительность и быстродействие даже таких чувствительных методов, как радиоизотопный и иммуноферментный. Кроме того, исследование флуоресценции позволяет получить информацию о состоянии живых систем, не повреждая их, и не требует большого количества биологического материала.

1. Обзор литературы

1. Основные характеристики флуоресценции

Термин «люминесценция» описывает эмиссию света, причиной которой являются возбужденные атомы и молекулы. Электроны в атомах и молекулах возбуждаются, если поступает энергия извне. Форма этой энергии может быть самой различной. Если излучение света происходит в результате биохимических процессов, то она называется биолюминесценцией. Если химическая реакция сопровождается излучением света, то это хемилюминесценция. Существует много молекул и молекулярных систем, которые излучают свет в результате поглощения света; это называется фотолюминесценцией [1].

1. Спектр люминесценции – спектральные линии или полосы, которые наблюдаются при люминесценции данного вещества. Характеризуются длиной волны или частотой линий люминесценции, либо длиной волны λmax (или частотой υ max) линии, соответствующей максимуму полосы люминесценции, а также шириной этой полосы Δλ (или Δυ). По спектру люминесценции определяют вид люминесцирующего вещества, а по интенсивности – его концентрацию и другие важные характеристики.

2. Длительность люминесценции τ – это время, за которое интенсивность люминесценции уменьшается в е = 2,7 раз; это время жизни электронов в возбужденном состоянии, в результате оптических переходов из которого в основное состояние и возникает люминесценция.

3. Квантовый выход люминесценции γ – это отношение числа квантов люминесценции к количеству квантов, поглощенных при возбуждении молекулы: γ = n_люм/n_погл. Квантовый выход всегда меньше единицы (γ < 1) из–за наличия неоптических переходов. Вещество считается хорошо люминесцирующим, если его квантовый выход γ > 0,01, т.е. если γ > 1%.

4. Спектр возбуждения – это зависимость интенсивности фотолюминесценции от длины волны возбуждающего излучения (для многих молекул он совпадает с их спектром поглощения) .

5. Степень поляризации люминесценции – это степень поляризации излучения люминесценции, когда ее возбуждение производится линейно поляризованным светом, – позволяет оценить скорость вращения люминесцирующей молекулы и микровязкость ее окружения.

Каждое люминесцирующее вещество имеет свой индивидуальный спектр люминесценции, что используется при исследовании структуры веществ с помощью люминесцентного анализа. По спектру люминесценции можно определить как вид, так и концентрацию люминесцирующего вещества. Люминесцентный анализ чувствительнее абсорбционного (по спектрам поглощения) спектрального анализа более чем в 1000 раз. Так, он позволяет определить наличие люминесцирующего вещества в смеси при ничтожно малых концентрациях: до 10 – 12 г/л при квантовом выходе всего около одного процента [2].

Спектры люминесценции очень чувствительны к химическим свойствам окружения (полярности, pH, концентрации, вязкости и др.) люминесцирующей молекулы, что широко используются в биохимических исследованиях. Люминесценция позволяет изучать изменения конформации макромолекул, а при использовании люминесцентного микроскопа изучать и локализацию люминесцирующих молекул внутри клетки [3].

Измерять люминесценцию можно различными способами. На их основе можно распознавать молекулы и различные вещества, а в некоторых случаях получать и количественные характеристики. Люминесценцию можно использовать для зондирования окружения излучающего люминофора. Люминесцентный зонд чрезвычайно чувствителен даже к незначительным изменениям такой сложной системы, как живая клетка. Задачей спектроскописта является анализ подобных сигналов [4].

В данной работе внимание будет сосредоточено на отдельной разновидности фотолюминесценции – флуоресценции. Сам термин флуоресценция произошел от названия минерала плавиковый шпат (fluorspar), свечение которого впервые наблюдалось в 1565 г.

Флуоресценция — физический процесс, разновидность люминесценции. Флуоресценцией обычно называют излучательный переход возбужденного состояния с самого нижнего синглетного колебательного уровня S₁ в основное состояние S₀. В общем случае флуоресценцией называют разрешенный по спину излучательный переход между двумя состояниями одинаковой мультиплетности: между синглетными уровнями S₁→S₀ или триплетными Т₁→ Т₀ Типичное время жизни такого возбужденного состояния составляет 10⁻¹¹−10⁻⁶с [5].

Спектр флуоресценции сдвинут относительно спектра поглощения в сторону длинных волн. Это явление получило название «Стоксов сдвиг». Его причиной являются безызлучательные релаксационные процессы. В результате часть энергии поглощенного фотона теряется, а испускаемый фотон имеет меньшую энергию, и, соответственно, большую длину волны [6].