20

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.Э. БАУМАНА

(МГТУ им. Н.Э. Баумана)

Утверждено Редсоветом

МГТУ им. Н.Э. Баумана

УДК 615.47:616-074

Г.Н. Змиевской, А.В. Кобелев

СПЕКТРАЛЬНЫЙ КОМПЛЕКС ТИПА КСВУ-23

В БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Методические указания

к проведению лабораторной работы

по курсу

«Биомедицинская оптика»

Под редакцией И.Н. Спиридонова

Москва 2008 г.

Целью настоящей работы является ознакомление с методами спектрального анализа в биомедицинских исследованиях на примере изучения возможностей модифицированного спектрального комплекса КСВУ-23.

Введение. Основные понятия спектрального анализа в оптическом диапазоне.

Оптическим диапазоном электромагнитных волн принято считать область длин волн 10 нм…1000 мкм. Оптический диапазон подразделяется по длинам волн на ультрафиолетовое излучение (10…400 нм), видимое (400-760 нм) и инфракрасное (0,76…1000 мкм). Иногда нижнюю границу видимого диапазона опускают до 380 нм, чтобы на видимый свет приходилась ровно одна октава (изменение длины волны в 2 раза), но многочисленный опыт наблюдений в коротковолновом участке видимого спектра говорит о том, что для восприятия большинства людей излучение с длиной волны короче 400 нм недоступно.

Любой периодический процесс, как известно, можно представить в виде суммы гармонических колебаний. Принято называть спектром распределение интенсивности излучения по длинам волн или частотам.

Для представления спектров используют различные величины, характеризующие волновой процесс. Наиболее общей является частота колебаний, однако в силу ряда причин в практической спектроскопии непосредственное измерение частоты крайне затруднительно (прежде всего потому, что оптическая частота представляет собой большую величину, и для ее регистрации быстродействие традиционных фотоприемных устройств недостаточно). Поэтому обычно используется шкала длин волн.

Часто используется для спектральных измерений величина, обратная длине волны и называемая волновым числом. Если выражать длину волны в микрометрах, то для волнового числа удобно использовать формулу

, (1)

в результате получается волновое число в обратных сантиметрах.

В зависимости от физической природы изучаемого явления различают эмиссионные спектры (спектры испускания); абсорбционные спектры (спектры поглощения); трансмиссионные спектры (спектры пропускания); люминесцентные спектры, объединяющие анализ поглощенного и испущенного в процессе люминесценции излучения; спектры рассеяния (в том числе комбинационного рассеяния) и т.д. В целом оптический спектральный анализ сегодня представляет собой исключительно продвинутую и всеобъемлющую область исследований.

Особенно важное значение достижения оптического спектрального анализа имеют в биологии и медицине, поскольку характерные частоты возбуждения биомолекул и различных биомолекулярных комплексов находятся как раз в оптическом диапазоне. Следовательно, владея методами неразрушающего контроля состояния биообъектов, можно с помощью спектрального анализа получать уникальную информацию, недоступную для других методов исследования.

Спектр чаще всего изображается графически в виде зависимости от длины волны или частоты (реже ― от пространственной частоты) какой либо оптической характеристики исследуемого объекта (поток излучения, коэффициент поглощения, коэффициент пропускания и т.п.). Распространено также представление спектра в виде таблиц, что менее наглядно, зато более удобно для количественного анализа. Обычно исследователь имеет под рукой и табличное, и графическое представление спектров.

1. Основные элементы спектрального прибора.

1.1. Дифракционная решетка.

Основным элементом схемы всякого спектрального прибора является диспергирующий элемент, осуществляющий разложение исследуемого излучения на монохроматические составляющие. В монохроматоре МДР-23, входящем в состав комплекса КСВУ-23, в качестве таковых применяются сменные дифракционные решетки.

В современных спектральных приборах используются ступенчатые отражательные плоские дифракционные решетки – эшелетты, позволяющие концентрировать максимум световой энергии в нужной области спектра. Такие решетки представляют собой совокупность узких равноотстоящих параллельных зеркальных полос с треугольным профилем штриха и устанавливаются в параллельных пучках лучей, выходящих из объектива коллиматора. При падении на эшелетт параллельного пучка лучей на каждой зеркальной площадке имеет место дифракция Фраунгофера, причем пучки, дифрагированные на всех площадках, интерферируют между собой. Картина аналогична многолучевой интерференции, происходящей в интерферометре типа Фабри-Перо.

Положение главных максимумов дифракционной решетки зависит от длины волны:

(2)

где d- период решетки (расстояние между соседними штрихами), ₀ – угол падения исследуемого пучка на решетку,  - угол наблюдения дифрагированного пучка, m – порядок наблюдаемого спектра (целое число),  - длина волны излучения.

Соотношение (2) называют основным уравнением плоской дифракционной решетки.

Максимальная концентрация энергии света в рабочем порядке спектра для современных решеток достигает 80%. В серийных спектральных приборах используются, как правило, эшелетты со стандартизованными числами штрихов на 1 мм: 100, 200, 300, 600, 1200, 1800, 2400.

Как видно из (2), только в нулевом порядке (m = 0) положение главных максимумов не зависит от длины волны. Монохроматические составляющие анализируемого спектра можно считать независимыми. Поэтому решетка в каждом порядке разложит падающий свет в спектр, в котором отдельные монохроматические составляющие пространственно разделены. Главные максимумы, соответствующие m = 1, образуют спектр первого порядка, за ними идут спектры второго, третьего и т.д. высших порядков. Спектр каждого порядка (если считать, что падающий свет – белый) имеет вид цветной полосы, причем наиболее сильно отклоняются красные лучи, наименее – фиолетовые. Заметим, что положение соответствующей линии в спектре определяется значительно более простой формулой, чем для интерференционных или призменных спектральных приборов. В спектроскопии спектр называют нормальным, если координата, характеризующая положение линии в спектре, линейно меняется с длиной волны. При малых углах дифракции, когда можно принять (проводя аналогию с геометрической оптикой – в случае «параксиальных» дифрагирующих пучков), дифракционная решетка дает нормальный спектр. Это очень важное обстоятельство при калибровке спектральных приборов.

Основными характеристиками дифракционной решетки, как и других спектральных приборов, являются дисперсия, дисперсионная область и разрешающая способность. Рассмотрим их подробнее.

Дисперсия решетки подразделяется на угловую и линейную. Принимая угол падения лучей на решетку ₀ = const и дифференцируя основное уравнение решетки (2), получим:

(3)

Угловой дисперсией называется производная , определяющая расстояние в спектре между двумя спектральными линиями с фиксированными . Из (3) имеем:

(4)

Следовательно, угловая дисперсия при заданных параметрах решетки определяется углами  и ₀. Это значит, что используя скользящее падение исследуемого света на решетку (₀    2), можно значительно увеличить пространственное разделение компонент в спектре. В самом деле, сохраняя требование «параксиальности» дифрагированных пучков, т.е. малого отклонения дифрагированного света от первоначального направления, формулу (2) в случае скользящего падения можно переписать в виде

Это выражение аналогично тому, что мы рассматриваем нормальный спектр при нормальном падении (₀  0). Однако вместо «нормального» периода решетки здесь появился «скользящий» период dcosβ₀ , который при β₀→π∕2 может быть сделан очень малым. Благодаря такому изящному приему можно без труда наблюдать в белом свете дифракционные спектры от «решеток» в виде граммофонных пластинок, а в случае настоящих дифракционных решеток с большим числом штрихов на миллиметр (см. выше) – уверенно наблюдать рентгеновские спектры. Именно так были получены первые картины рентгеновских спектров, причем ситуация в рентгеновском диапазоне благоприятствует еще и тем, что показатель преломления рентгеновских лучей меньше единицы. Это значит, что с помощью обычных отражательных решеток оптического диапазона можно получать полное внутреннее отражение рентгеновских лучей и измерять длину волны в рентгеновском диапазоне с точностью, не уступающей оптическому диапазону. Но, поскольку рентгеновское излучение испытывает дифракцию на естественных кристаллах (эффекты Лауэ и Брэгга-Вульфа), можно тем самым измерять и постоянные кристаллических решеток. Итак, дифракционная спектроскопия позволяет «перебросить мостик» от оптического диапазона к нанодиапазону и дать метрологическое обеспечение для рентгеноструктурного анализа. Это имеет огромное методологическое значение для изучения структуры биомолекул, поскольку им, как и неорганическим кристаллам, присущи квазипериодические свойства.

Если после решетки стоит оптическая система (выходной коллиматор), то наряду с угловой дисперсией вводится линейная дисперсия dl/dλ:

(5)

где f₂^* - заднее фокусное расстояние объектива коллиматора, l – поперечная линейная координата (расстояние от оптической оси). Линейная дисперсия является вспомогательной характеристикой, зависящей от параметров используемой оптической системы.

Дисперсионной областью решетки называется максимальная ширина спектрального интервала Δλ, при которой еще нет перекрытия спектров соседних порядков.

Пусть длины волн падающего излучения лежат в интервале от λ до λ΄ = λ+Δλ. Если при этом положения крайних компонент в спектрах m и (m+1)-го порядков совпадают, то

т.е. , и, следовательно,

(6)

Это и есть дисперсионная область дифракционной решетки в рассматриваемом участке спектра. Дисперсионную область называют также спектральной областью свободной дисперсии, подчеркивая «свободу» от перекрытия спектров соседних порядков. В связи с этим вводится также угловая область свободной дисперсии, определяемая как изменение угла dβ между направлениями одной и той же длины волны для соседних порядков в спектре. Эта величина получается дифференцированием основного уравнения решетки по m при постоянных β₀, d и λ. Именно,

(7)

Заметим, что угловая область свободной дисперсии не зависит явно от порядка спектра. Напротив, дисперсионная область Δλ тем больше, чем меньше порядок спектра. Это значит, что, работая в спектрах низких порядков, можно исследовать весьма широкие участки спектра, в отличие от интерференционных спектральных приборов.

Большая дисперсия спектральных приборов еще не означает, что две спектральные линии с близкими λ непременно разрешаются, т.е. воспринимаются как раздельные. В самом деле, каждая спектральная линия, как бы она ни была узка, изображается на выходе спектрального прибора в виде более или менее размытой фраунгоферовской дифракционной картины. Дисперсия определяет расстояние, на которое разводятся центры дифракционных картин от отдельных линий с различными длинами волн. Если сами картины размыты и имеют значительную ширину, то даже при сравнительно большом разведении они будут восприниматься как картина от одной спектральной линии. Наименьшая разность длин волн двух спектральных линий δλ, при которой спектральный прибор разрешает эти линии, называется спектральным разрешаемым расстоянием, а величина ― разрешающей способностью. Ситуация аналогична предельному разрешению, даваемому оптическими приборами, и требует введения определенного критерия разрешения. Для определения разрешающей способности используется критерий Рэлея, согласно которому две спектральных линии считаются разрешенными, если главный максимум для одной длины волны совпадает по своему положению с первым минимумом в том же порядке для другой длины волны. Положение первого (побочного) минимума для длины волны λ, определяется для решетки с N штрихов, как известно, условием

(8)

Потребовав, чтобы то же условие давало максимум для длины волны λ΄= λ+δλ, запишем

Отсюда , и

(9)

Общее число штрихов N решетки естественно связать с периодом решетки d, поскольку (где N΄ - число штрихов на 1 мм, а N d=B ― общая ширина нарезанной части решетки). Для повышения разрешающей способности можно либо увеличивать число штрихов N΄, либо порядок спектра m. Но увеличение порядка, как мы установили выше, ведет к уменьшению дисперсионной области. Поэтому в дифракционных спектральных приборах идут по пути увеличения числа штрихов. В монохроматоре МДР-23 имеются решетки с 600 и 1200 штр/мм. При размерах решетки 100х100 мм общее число штрихов достигает 120 000, что для λ = 500 нм соответствует разрешаемой разности спектральных линий в первом порядке ~4·10^-3 нм.