Межвидовое цветное сегментирование хромосом (RxFish)

Использование в 24-х цветной FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб человека позволяет определять происхождение районов хромосом размером более 10 МВ, но, как уже обсуждалось выше, практически исключает возможность анализа большинства внутрихромосомных перестроек. Для их анализа требуются ДНК-пробы, специфичные не целым хромосомам, а их отдельным районам. В качестве таких проб были использованы комбинации WCP двух видов гиббонов [33; 34]: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus. Сегментационное окрашивание хромосом человека при использовании WCP гиббонов обусловлено многочисленными межхромосомными перестройками, различающими хромосомы человека и гиббонов. Разработанный метод получил название RxFISH. В отличие от 24-цветной FISH, он позволяет выявлять часть внутрихромосомных перестроек. ДНК-пробы, используемые в R_XFISH, мечены комбинацией 3-х флуорохромов, что обеспечивает всего лишь 7 псевдоцветов. В эти цвета окрашиваются отдельные сегменты хромосом человека, создавая цветную исчерченность хромосом (рис. 12). Очевидно, что, несмотря на всю фантастичность картины R_XFISH, использование этого метода имеет достаточно серьезные ограничения: перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного R_X-бэнда, не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям его размера. Комплексные хромосомные перестройки часто также оказываются за пределами возможностей использования этого метода из-за небольшого числа псевдоцветов, описывающих хромосомные районы.

К недостаткам R_XFISH можно отнести большой размер многих цветных районов. А такие хромосомы, как 15, 18, 19, 21, 22, X и Y представляют собой один цветной бэнд каждая. Использование в будущем большего числа флуорохромов и новых ДНК-проб, полученных благодаря использованию искусственных хромосом или микродиссекции метафазных хромосом, может значительно повысить разрешающую способность данного метода.

Многоцветный бэндинг хромосом (Multi Color Banding - mcb).

В отличии от 24-х цветной и RxFISH метод многоцветного окрашивания хромосом человека предназначен для детального анализа индивидуальных хромосом [8]. В его основе лежат микродиссекционные районоспецифичные ДНК-библиотеки, многоцветная FISH, цифровая видеозапись микроизображений и их специализированная обработка. Цифровая запись микроизображений и компьютерная обработка позволяют перевести в псевдоцвета не только комбинации флуорохромов, но и соотношения их интенсивностей. Данная система была разработана сотрудниками Института генетики человека Университета города Йены (профессор Уве Клауссен, доктор Ильза Худоба) в сотрудничестве с фирмой MetaSystems GmbH.

Комплекты микродиссекционных ДНК-библиотек для МСВ всех хромосом человека были получены Институтом генетики человека Йенского Университета в сотрудничестве с Институтом цитологии и генетики СО РАН. Аналогичные микродиссекционные ДНК-пробы также коммерчески доступны в фирме MetaSystems GmbH (http://www.metasystems-international.com). Комплект ДНК-проб для индивидуальной хромосомы представляет собой набор микродиссекционных ДНК-библиотек, каждая из которых обеспечивает необходимый профиль интенсивности сигнала в пределах соответствующего хромосомного района. Уровень сигнала каждой из микродиссекционных районоспецифических ДНК-библиотек варьирует по интенсивности, достигая максимума в центре и постепенно падая практически до нуля на его границах. Мечение ДНК-библиотек флуорохромами проводится таким образом, чтобы после FISH не возникало одинаковых комбинаций флуорохромов в разных хромосомных районах. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК-проб обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценции различных флуорохромов вдоль хромосомы. В результате программной обработки изображения каждому из хромосомных районов, характеризующихся уникальной комбинацией сигналов разных флуорохромов присваивается свой псевдоцвет (рис. 13). Программное обеспечение, необходимое для обработки микроизображений и генерации МСВ, в настоящее время входит в пакеты программ фирмы MetaSystems GmbH.

Метод МСВ дает идентичный цветной «bar-код» на хромосомах различного уровня конденсации, что обеспечивает высокий уровень разрешения даже при анализе высококонденсированных хромосом и хромосом с нечеткой морфологией, характерных для цитологических препаратов малигнизированных клеток. При анализе аномальных хромосом, содержащих участок анализируемой хромосомы, возможно определение его локализации, а в случае достаточного размера и его ориентации. При анализе маркерной хромосомы, состоящей из участка анализируемой хромосомы, МСВ, отличие от традиционных методов M-FISH, позволяет провести не только определение хромосомного происхождения, но и идентификацию хромосомных районов, формирующих маркерную хромосому, и определить их ориентацию [19].