Регистрация сигнала при проведении cgh.

CGH базируется на цифровой обработке полученных микроскопических изображений, в ходе которой оценивается соотношение интенсивностей флуоресцентных сигналов исследуемой и контрольной ДНК вдоль каждой хромосомы, так называемое флуоресцентное соотношение (ФС) [11, 20, 24]. При отсутствии численного дисбаланса в исследуемой ДНК, ФС принимает значения, близкие 1,0. По отклонениям профиля ФС от этого значения определяют недостаток (ФС<1,0) или избыток (ФС>1,0) хромосомного материала [5, 6]. Таким образом, при трисомии по определенной хромосоме значение ФС будет близко к 1,5, а при делеции или моносомии – около 0,5 [10, 29]. С помощью метода CGH идентифицируют несбалансированные хромосомные нарушения, размер которых не менее 10-15 млн пар оснований [11]. Для оценки возможности количественной регистрации сигнала FISH рассмотрим еще некоторые модельные эксперименты [4]. Исследование выполнено на ДНК-пробах хромосом человека 4, 8, 13 и 16. Для обеспечения воспроизводимой разницы в сигнале после проведения FISH ДНК этих хромосом метили, используя в ник-трансляции различные концентрации биотин-11-dUTP и дигоксигенин-11-dUTP. В результате их соотношение в ДНК-пробах варьировало от 1/64 до 64/1 (1/64, 1/16, 1/4, 1/1, 4/1, 16/1, 64/1). Отношения интенсивностей сигналов были близки к ожидаемым в вариантах мечения 1/4, 1/1, 4/1 и значительно отличались от таковых в вариантах 1/64, 1/16, 16/1, 64/1. Причем в вариантах 16/1 и 64/1, а также 1/64 и 1/16 соотношения интенсивностей практически не отличались друг от друга. Вероятно, при этих разведениях регистрируемый сигнал уже практически не отличался от фонового. При использовании прямомеченных ДНК-проб можно ожидать несколько более широкого рабочего диапазона при проведении CGH, однако, и диапазон регистрации интенсивности сигналов при непрямом мечении покрывает большинство потребностей при проведении диагностики.

Необходимо также учитывать ряд особенностей при регистрации изображений для CGH. Стандартным оборудованием для такой регистрации являются CCD-камеры (Charge Couple Device). В связи с этим необходимо помнить, что прямая зависимость между интенсивностью сигнала и его зарегистрированным значением с помощью CCD-камеры выдерживается только на части ее динамического диапазона. Это требует определения правильного времени экспозиции, при котором еще не проявляется эффект заполнения сенсора. Регистрация всех метафаз проводится с этим временем экспозиции, одинаковым для всех метафазных пластинок препарата.

Анализ микроскопических изображений при cgh.

Для дальнейшей обработки полученных изображений используются специализированные модули программного обеспечения, входящие в состав программного продукта практически всех ведущих фирм (ISIS 4.0, MetaSystems, Altlussheim, Germany; VideoTesT-CGH, VideoTest, S.-Peterburg, Russia; Leica4000 CGH, Leica Microsystems, Cambridge, UK и др.). Запись изображений идет по трем отдельным каналам: регистрируется общая окраска хромосом красителем DAPI и сигналы двух флуорохромов, использованных для мечения ДНК или детекции меченой ДНК при непрямом варианте мечения. Важным условием является проведение люминесцентной микроскопии, исключающей возможность регистрации сигнала флуорохромов в посторонних каналах. Это обеспечивается правильным набором комплектов фильтров. Для успешной CGH необходимо проведение идентификации всех хромосом. Для этого в программном обеспечении предусмотрены специальные модули для кариотипирования, которое проводится в интерактивном режиме, так как до настоящего времени решение квалифицированного цитогенетика остается более надежным способом идентификации хромосом, чем использование исключительно программного обеспечения.

Важным этапом компьютерной обработки микроизображений является нормализация интенсивностей флуоресцентных сигналов ДНК-проб и определение соотношения сигнала к фону [20]. Получение сегментационной маски хромосом или хромосомной исчерченности выполняется с помощью автоматической обработки изображения хромосом, окрашенных флуорохромом DAPI. Полученная в ходе компьютерной обработки дифференциальная исчерченность хромосом сопоставима по качеству с уровнем исчерченности, который наблюдается при GTG-окрашивании. Учитывая, что CGH проводится на препаратах хромосом только очень высокого качества, обычно не возникает каких-либо проблем с их идентификацией.

Цифровое значение зарегистрированной интенсивности флуоресцентных сигналов определяется пропускной способностью фильтров, чувствительностью CCD-камеры, временем экспозиции, эффективностью мечения ДНК и качеством проведенной гибридизации in situ. При использовании качественных ДНК-проб и корректном выполнении FISH получение значений в правильном динамическом диапазоне может быть легко достигнуто коррекцией времени экспозиции при регистрации сигнала. Проблемы могут возникнуть при слабом специфическом сигнале, когда значительную часть зарегистрированного сигнала представляет фоновый сигнал. Однако, неправильный выбор времени экспозиции может привести к неудаче даже при очень сильном специфическом сигнале. Проблема отклонения от прямой зависимости между интенсивностью сигнала и его зарегистрированным значением при использовании CCD-камер уже обсуждалась выше.

Как таковое, абсолютное значение зарегистрированной интенсивности флуоресцентных сигналов важно только для оценки правильности в определении условий съемки. Для дальнейшего анализа проводится сравнение интенсивностей флуоресцентных сигналов во всех районах хромосом [24]. Для получения относительных значений интенсивностей свечения флуорохромов, проводится их нормализация: контуры хромосом, выявленных красителем DAPI, накладываются на изображения, записанные в каналах, соответствующих контрольной и тестируемой ДНК, и, таким образом, определяются границы обрабатываемых участков изображения (рис. 2). C деталями компьютерной обработки можно ознакомиться в статье Пайпера с соавторами [24]. Однако, обычно это не является необходимым условием для успешного использования соответствующего программного обеспечения.