Криоконсервация

В клинике Боннского университета мы обычно криоконсервируем не более 4-5 аликвот тестикулярного гомогената, так как по нашему опыту пациенты не нуждаются в более чем 4 циклах ИКСИ. При наличии достаточного количества сперматозоидов, осадок ресуспендируют в 1,5 мл культуральной среды с буфером HEPES и добавляют 1,05 мл раствора для замораживания спермы (70% от 1,5 мл=1,050 мл; это соотношение зависит от типа среды для замораживания, в другой лаборатории может быть другое соотношение). Чрезвычайно важно добавлять среду для замораживания спермы медленно - "каплю за каплей" - иначе сперматозоиды будут травмированы осмотическим шоком. Общий объем гомогената, подготовленного для замораживания (2,5 мл), распределяется по 4-5 крио-пробиркам, по 0,5 мл в каждой. Перед началом замораживания крио-пробирки выдерживают в течение 15 минут. Процесс замораживания можно проводить в специальных аппаратах или просто, помещая крио-пробирки на 30 минут в пары кипящего азота (5-8см выше уровня жидкого азота). Подобно другим криоконсервированным объектам, тестикулярные сперматозоиды могут сохраняться живыми длительное время, после чего их возможно использовать в программах ИКСИ.

Размораживание

Для размораживания крио-пробирку извлекают из крио-хранилища и мгновенно погружают в теплую воду (37С). Содержимое крио-пробирки переносят в пробирку для центрифугирования 1,5 мл и добавляют в нее 1 мл теплой среды с буфером HEPES. Содержимое пробирки перемешивают и подвергают центрифугированию в течение 2-3 мин при 2000g. Затем удаляют супернатант, осадок ресуспендируют в 20-40 мкл среды. Сразу после ресуспендирования материал объемом 5 мкл помещают в чашку для ИКСИ (см. ниже).

Икси с использованием тестикулярных сперматозоидов

Для одного пациента подготавливают 1-2 чашки для ИКСИ, как показано на рисунке.

Чашка для инъекции в программе TESE-ICSI

3-5 мкл 10% ПВП

3-5 мкл среды с HEPES / одна капля на ооцит

50 мкл среды с HEPES + 5-10 мкл суспензии

Капли покрыты минеральным маслом

Необходимо обратить внимание, чтобы в каплю не попало избыточное количество тестикулярной суспензии. Мы предлагаем следующую схему работы: 10мкл суспензии вносят на поверхность капли №1 и перемешивают "пипетированием". Далее 10мкл из капли №1 переносят в каплю №2 и также перемешивают. Оценивают концентрацию в каплях №1 и №2 с помощью инвертоскопа: если суспензия слишком густая, переносят 10мкл суспензии из капли №2 в каплю №3.

Удобно удалить из капель крупные частицы ткани, так как они могут засорить капилляры. Перед изоляцией сперматозоидов необходимо выбрать инструмент для этой манипуляции. Если концентрация сперматозоидов мала, используют большее количество материала, суспензия в капле будет плотнее. Из-за повышенной плотности трудно использовать для изоляции сперматозоидов обычную иглу ИКСИ, так как она легко засорится дебрисом. В этом случае рекомендуют использовать специальный капилляр для изоляции сперматозоидов (D=10-15 мкм), также подойдут капилляры для изоляции полярного тельца (D=16-20 мкм).

Если концентрация сперматозоидов оптимальная, и сперматозоиды могут быть изолированы без риска засорить капилляр, можно использовать иглы ИКСИ. Сперматозоиды набирают в иглу головкой вперед, так как это проще технически. Сперматозоиды переносят либо непосредственно в каплю среды с ПВП, либо сначала в каплю свежей культуральной среды (если процедуру ИКСИ планируют провести более чем 30 минут спустя изоляции). Очень важно вводить капилляр в каплю под маслом сверху вниз (вертикально).

Основным критерием для выбора сперматозоида является его подвижность. Обычно сперматозоиды быстро оседают на дно чашки и может уйти до 10 минут на поиск сперматозоида. Однако после длительного культивирования (1-2 часа) сперматозоиды созревают, и некоторые приобретают подвижность. Поэтому удобно наполнить капли тестикулярной суспензией за 2 часа до начала ИКСИ. Обычно не удается обнаружить сперматозоиды с прогрессивным движением, а лишь обладающие слабой подвижностью, зачастую заметно лишь небольшое шевеление хвостом. Для того, чтобы заметить слабую подвижность необходимо следить за сперматозоидом в течение 20-30 сек.

Внимание! В тестикулярном препарате наблюдается неспецифическая подвижность сперматозоидов вследствие броуновского движения. При таком неспецифическом движении хвост сперматозоида всегда неподвижен относительно головки.

Если подвижные сперматозоиды не обнаружены, проводят процедуру ИКСИ с использованием неподвижных сперматозоидов, предполагая, что среди них могут оказаться живые. Существуют 2 метода определения жизнеспособности сперматозоидов в чашке ИКСИ, описанные в литературе:

1. гипоосмотический тест (HOS-тест; Jeyendran et al., 1984) Этот метод подходит для не замороженных тестикулярных сперматозоидов, но плохо работает с криоконсервированными тестикулярными сперматозоидами. Жизнеспособные сперматозоиды, прошедшие HOS-тест, показаны на рисунке и могут быть использованы для ИКСИ, обеспечивая высокий уровень оплодотворения.

2. Лазерный тест, описанный недавно (Aktan et al., 2004), основан на наблюдении, что живые неподвижные сперматозоиды сгибают хвост при поражении лазерным лучом.