Работа с тестикулярной тканью (Извлечение тестикулярных сперматозоидов)

В настоящее время существуют две стратегии работы с тестикулярной тканью, принципы которых кратко описаны ниже:

Метод 1. Замораживание цельной ткани, выделение сперматозоидов после оттаивания. Некоторые авторы отмечают лучшее сохранение тестикулярных сперматозоидов при замораживании цельной ткани (Salzbrunn et al., 1996). Хотя научная группа из Брюсселя показала, что при контрольном сравнении замораживание гомогената успешнее, чем цельной ткани. (Crabbé et al., 1999)

Недостатком замораживания цельной ткани является феномен неоднородного сперматогенеза. Часто бывает, что некоторые образцы ткани могут содержать семенные канальцы с нормальным сперматогенезом, тогда как другие образцы их не содержат. Это означает, что информация о наличии сперматозоидов в достаточном для ИКСИ количестве будет получена только после размораживания образцов.

Метод 1. Замораживание гомогената ткани. Долгое время лаборатория ЭКО Боннского университета использовала замораживание цельной тестикулярной ткани. Д-р Монтаг изменил стратегию лаборатории и предложил замораживать гомогенат. Основной причиной изменения методики стало то обстоятельство, что при замораживании гомогената качество всех порций одинаково, и поэтому прогнозируемо. Но кроме того, после изменения стратегии криоконсервации успех программ TESE стремительно возрос. Это показывает, что сперматозоиды, замороженные в суспензии, лучше сохраняют способность к оплодотворению по сравнению со сперматозоидами, замороженными в цельной ткани.

Приготовление гомогенной тестикулярной суспензии

Существует два метода изготовления гомогенной тестикурярной суспензии: механический и ферментный. При ферментном методе тестикулярная ткань выдерживается в течение 6 часов в присутствии химотрипсина. Методика требует времени. Ферментный метод не рассматривается на практикуме TESE, интересующиеся могут обратиться к статье Salzbrunn et al., 1996.

Механический метод, описанный ниже, требует всего несколько минут времени. Объемное исследование, проведенное в Германии, не выявило различий в эффективности программ TESE-ICSI при использовании механического и ферментного методов (Baukloh, 2002 – полный текст на CD)

Механическое выделение тестикулярных сперматозоидов

Процедуру проводят на подогреваемой поверхности 37С в стерильном кабинете или под ламинарным потоком воздуха. В большую чашку Петри помещают стерильное предметное стекло и подогревают на термостолике. Тестикулярную ткань извлекают из транспортировочной пробирки и помещают в чашку Петри, смачивая 3-4 мл среды с буфером HEPES. Для оценки неравномерности сохранения сперматогенеза в тестисах и большего соответствия результатам гистопатологического исследования каждый кусочек ткани обрабатывают отдельно. Измельчение ткани производят на предметном стекле, расположенном внутри чашки Петри, иначе кусочки пластика могут загрязнить ткань.

Чашка со стеклом, тестикулярная ткань человека, скальпель и стекло

Существует 2 метода измельчения тестикулярной ткани:

1. Измельчение двумя скальпелями до образования частиц размером 1-2 мм.

2. Измельчение одним скальпелем и одним стерильным предметным стеклом (или даже только стерильными стеклами). Необходимо делать режущие и надавливающие движения краями предметных стекол, а так же перетирать ткань плоскими поверхностями. Этот метод позволяет выдавливать сперматозоиды непосредственно из канальцев.

Тестикулярная суспензия после

измельчения скальпелем и стеклом

Пробирка Eppendorf и пестик

После достаточного измельчения тестикулярную ткань помещают с помощью шприца 1 мм или пипетки в пробирку 1,5-2мл (например, Eppendorf). Необходимо, чтобы ткань опустилась на дно пробирки. После этого ткань споласкивают средой, которую собирают в пробирку 5мл. Специальный пестик помещают в пробирку, и ткань тщательно перетирают. Для этого пестик медленно поднимают и опускают вниз, постепенно вращая.

П олученный гомогенат переносят в пробирку 5 мл, в которую до этого была перенесена среда. В эту же пробирку переносят гомогенаты всех полученных образцов ткани. Когда все гомогенаты будут объединены в одну пробирку, содержимое "пипетируют" шприцом с длинной иглой для разрушения оставшихся семенных канальцев и кусочков тканей. Если в гомогенате обнаружены крупные кусочки ткани, то для освобождения от них гомогенат осторожно переносят в новую пробирку 5мл.

Перед дальнейшей обработкой гомогената небольшой его объем (10мкл) помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом с фазовым контрастом (40х). Препарат тщательно исследуют на предмет наличия сперматозоидов, элонгированных или круглых сперматид. Концентрация сперматозоидов даёт представление о том, как много аликвот может быть заморожено для будущих попыток ИКСИ. Обычно подвижные сперматозоиды на этом этапе отсутствуют, так как тестикулярные сперматозоиды приобретают подвижность после длительного культивирования в среде. Если приблизительно 10 сперматозоидов обнаружены на целом препарате, потребуется 100-300 мкл гомогената для одной процедуры ИКСИ. Таким образом можно рассчитать количество аликвот для криоконсервации.

После микроскопического исследования гомогенат центрифугируют 5 минут при 600-900 g. Если при первом исследовании сперматозоиды в гомогенате не обнаружены, нужно провести повторное исследование. Для этого осадок ресуспендируют в 100мкл среды, помещают пробу объемом 5мкл в чашку под масло и осматривают с помощью инвертоскопа. Если сперматозоиды также не обнаружены, весь гомогенат замораживают как единую порцию. Для прогноза обнаружения сперматозоидов после размораживания следует воспользоваться результатами гистологического исследования.

Если сперматозоиды были обнаружены при первом микроскопическом исследовании, осадок ресуспендируют в 0,5-1,5 мл культуральной среды с буфером HEPES в зависимости от размера осадка и концентрации сперматозоидов.