60. Методы
Физические методы Ультрацентрифугирование (седиментационный анализ) — получило широкое распространение после изобретения в 1926 г. Т. Сведбергом аналитической ультрацентрифуги, с помощью которой он впервые определил молекулярную массу гемоглобина (68 кДа). В этом методе скорость седиментации (осаждения) определяется размером и формой разделяемых компонентов и выражается коэффициентом седиментации S. В 40 — 50-е годы ХХ в. А. Клод и Ж. Браше разработали метод дифференциального центрифугирования для разделения органелл клетки, с помощью которого де Дюв (de Duve) в 1953 г. впервые выделил лизосомы, а затем — пероксисомы. В 1957 г. М. Месельсон, У. Сталь и Дж. Виноград разработали метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия для разделения нуклеиновых кислот, с помощью которого было установлено, что репликация ДНК осуществляется полуконсервативным путем. Различные варианты метода ультрацентрифугирования широко используют в молекулярно-биологических исследованиях для выделения внутриклеточных компонентов и макромолекул (нуклеиновых кислот и белков), а также определения их молекулярных масс и коэффициентов седиментации. Хроматография — метод, впервые изобретенный русским ученым М.С. Цветом, который в 1906 г. фракционировал окрашенные экстракты листьев растений на колонках с порошком мела. В настоящее время существует большое количество вариантов хроматографии, в которых используют матриксы (носители) разных типов, позволяющие разделить белки по заряду (ионообменная хроматография), размеру молекул (гель-хроматография, чаще называемая гель-фильтрацией) или способности специфически взаимодействовать с определенными химическими группами веществ, предварительно связанных с матриксом (аффинная хроматография). Из всех вариантов хроматографии наибольшей эффективностью обладает аффинная хроматография (хроматография по сродству), в основе которой лежит специфическое взаимодействие (узнавание) молекул взаимодействующих веществ. Широкое распространение получила также высокоэффективная жидкостная хроматография. В этом методе используются специально разработанные кремнийорганические смолы, способные образовывать гомогенную среду в форме микросфер диаметром 3 — 10 мкм и позволяющие при высоком давлении осуществить быстрое равномерное протекание растворителя через колонку, при котором весь процесс хроматографии занимает считанные минуты и обеспечивает тонкое фракционирование смеси анализируемых молекул. Электрофорез — в основе этого метода лежит способность белков, обладающих определенным суммарным положительным или отрицательным зарядом, перемещаться в электрическом поле в соответствии с величиной заряда, размером и формой молекул. Электрофорез можно проводить в водном (буферном) растворе, однако, как правило, его проводят в каком-либо пористом (полимерном) носителе: крахмальном, агарозном или полиакриламидном геле, на целлюлозных или нитроцеллюлозных пластинах и т.д. Наиболее часто в настоящее время для разделения белков используют метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), который представляет собой инертный матрикс с высоким и контролируемым числом поперечных сшивок. Варьируя размеры гелевых пор, можно фракционировать белки, существенно отличающиеся по молекулярной массе (от нескольких десятков тысяч до сотен тысяч дальтон). Метод был разработан в 1959 г. Дальнейшей модификацией этого метода стал электрофорез в ПААГ с додецилсульфатом натрия, предложенный в 1966 г. Дж. Майзелем. Додецилсульфат натрия (ДСН, SDS, ДС-Na) представляет собой мощный ионный детергент, который вызывает разворачивание белковых молекул в вытянутые цепи и сообщает им избыточный отрицательный заряд. В начале 70-х годов ХХ в. в Швеции был разработан новый метод разделения белков в электрическом поле, получивший названиеизоэлектрофокусирования. В отличие от метода электрофореза, в процессе которого белки фракционируют при каком-то определенном значении рН, задаваемом электрофоретическим буферным раствором, при изоэлектрофокусировании белки разделяют в градиенте рН, создаваемом с помощью специальных реагентов (амфолинов). В процессе изоэлектрофокусирования белки передвигаются в электрическом поле в строгом соответствии только с зарядом молекул и останавливаются (фокусируются) в тех точках градиента рН, которые соответствуют их изоэлектрическим точкам (pI), т.е. там, где молекулы становятся электронейтральными. Разработанное в 1975 г. П. Офареллом сочетание методов изоэлектрофокусирования и электрофореза в ПААГ с SDS получило название двумерного электрофореза. В этой процедуре белки вначале обрабатывают β -меркаптоэтанолом и мочевиной, что приводит к их полному растворению, денатурации и диссоциации полипептидных цепей без изменения заряда. Далее проводят изоэлектрофокусирование в ПААГ, разделяя белки по заряду, а затем (в перпендикулярном направлении) ведут их электрофорез в блоке ПААГ с SDS, при котором белки разделяются по молекулярной массе. Таким образом, сочетая тонкое разделение вначале по заряду, а затем по размеру (массе), удается за один раз разделить до 2000 полипептидных цепей, т.е. проанализировать большинство всех белков бактериальной клетки. Биологические методы Культура клеток — этот метод берет начало с 1885 г., когда впервые было обнаружено, что клетки куриного эмбриона сохраняют жизнеспособность в солевом растворе. С 1907 г. стали использовать культуры фрагментов тканей (эксплантантов). В настоящее время используют диссоциированные культуры клеток, из которых можно получить клетки одного типа. Иногда в культуре клеток появляются мутанты, которые могут бесконечно размножаться и образовывать клеточную линию. В отличие от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, мутантные клетки лучше растут в контакте с какой-то поверхностью. Однородность клеточных линий можно повысить путем клонирования. Клон — это популяция клеток, происходящая от одной клетки-предшественницы. С помощью клонирования выделяют мутантные клеточные линии, у которых мутация затронула определенные гены. Такие клетки бывают нередко дефектны по какому-то определенному белку, что позволяет проанализировать его функцию в нормальных клетках. Слиянием двух клеток могут быть получены гетерокарионы – клетки с двумя отдельными ядрами. После митотического деления гетерокарион превращается в гибридную клетку, у которой все хромосомы объединяются в одном ядре. Такие гибридные клетки дают возможность изучать функции отдельных хромосом, взаимодействие внутриклеточных компонентов (митохондрий, ядер и др.) различных клеток. Их можно клонировать и получить гибридную клеточную линию. Существенно, что гибридные клетки нестабильны. В частности, гибридные клетки человек-мышь постепенно утрачивают хромосомы человека, что позволяет судить о функциях отдельных хромосом, осуществляя таким образом их генетическое картирование. Бесклеточные системы — незаменимы для изучения механизмов определенных молекулярных процессов, так как исключают различные побочные реакции, протекающие в клетке. В 1954 г. П. Замечник получил первую бесклеточную систему для изучения биосинтеза белка (трансляции). Возможности этих систем были далее блестяще использованы А.С. Спириным, М. Номурой и другими исследователями для изучения деталей трансляции. При этом из экстрактов клеток выделяли важнейшие компоненты белок - синтезирующей системы (мРНК, рибосомы, тРНК и др.), а затем последовательно вводили их в систему и уточняли роль каждого компонента в биосинтезе белка. С помощью бесклеточных систем был расшифрован генетический код, для чего в качестве мРНК использовали синтетические олиго- и полинуклеотиды известного состава. Моноклональные антитела — очень чувствительный инструмент выявления (идентификации) молекул в сложных смесях, и поэтому они находят очень широкое применение в молекулярной биологии. Антитела в целом представляют собой белки (иммуноглобулины), вырабатываемые позвоночными животными для защиты от чужеродных соединений — антигенов. Клетки позвоночных животных способны синтезировать колоссальное количество (108) различных форм антител, отличающихся участками узнавания антигенов. Именно высокая специфичность антител определяет их уникальные возможности для выявления различных молекул в клетке. Разработанный в 1976 г. метод включает клонирование В-лимфоцитов, секретирующих только определенный вид антител, благодаря чему эти антитела можно получать в больших количествах. Но время жизни В-лимфоцитов в культуре невелико, поэтому проводят их слияние с клетками, происходящими от «бессмертной» опухоли, также полученной из В-лимфоцитов. Из образовавшейся смеси клеток отбирают гибриды, способные развиваться в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Эти гибридные клетки называют гибридомами. Их клонируют по отдельности и получают клоны, каждый из которых является источником моноклональных антител. Моноклональные антитела происходят от одной-единственной клетки и обладают абсолютной специфичностью к белкам: они способны узнавать определенную конфигурацию группы из 5 — 6 аминокислотных остатков. Каждый тип антител можно далее использовать в качестве зонда для определения локализации белка в клетке и для очистки белков в аффинной хроматографии. В недалеком будущем моноклональные антитела могут стать источником для создания новой группы каталитически активных молекул — абзимов. Каталитически активные белки (ферменты) — важнейшие инструменты биохимических методов исследования. Они нашли широкое применение в молекулярной биологии, и конкретные примеры их использования будут приведены в последующих главах.