4. Клонирование и экспрессия (введение) генов в различных организмах

1. Клонирование в бактериях. В настоящее время разработаны системы клонирования в бак­териях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических со­единений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомицетами и Sacchammyces cerevisiae.

1. Е. coli - Векторы для клонирования в таких системах представляют со­бой двойные репликоны, способные существовать и в Е. coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой це­лью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. coli и требуемый репликон (из бактерий, дрож­жей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделенные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм.

2. В. subtilis — непатогенный почвенный микроорганизм. 20 различных видов бактерий синтезируют более 40 ферментов с внеклеточной локализацией.

3. -Стрептомицеты широко применяют в биотехнологии в каче­стве продуцентов антибиотиков.

2- Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно изу­чен вид S. cerevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках содержится 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно реп­лицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм.

Работа с дрожжами облегчается тем, что подоб­но бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, а такие имеют сравнительно короткое время реге­нерации (несколько часов) вследствие малого размера генома.

Этапы

1. Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно про­ста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты.

2. Их инкубиру­ют с ДНК в присутствии СаС1₂ и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК.

3. Дальнейшая инкуба­ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку.

3. Клонирование в клетках животных. Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функцио­нирования генов высших эукариот.

Предварительно клонированные гены вводят в клетку живот­ных различными путями (CaCl2 и Пэг). Для идентификации и пос­ледующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода мар­кера.

Способы:

1- В последние годы сконструировано большое количество так называемых челночных векторов и их рекомбинантных производ­ных, способных к репликации в животной и бактериальной клет­ках, экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. К числу таких векторов можно отнести векторы из плазмиды pBR322.

В боль­шинстве случаев чужеродная ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы утрачивают способность к репликации. Для ее функционирования используют «вирусы-помощники», синтезирующие продукты недостающих генов, за счет которых и существует рекомбинантный вирус. Обычно опу­холевые вирусы (в том числе SV-40) внедряют свою ДНК в хро­мосому клетки-хозяина и тем самым убивают ее при своем раз­множении.

2- Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК не­посредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фраг­мент вируса герпеса проник в ядра и нормально в них реплицировался.

Культуры клеток млекопитаю­щих могут быть эффективным источником выделения ряда вирус­ных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека.