3. Конструирование рекомбинантной днк

Сущность генетической инженерии сводится к целенаправ­ленному конструированию генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привно­сят в него новые генетические и физиолого-биохимические свой­ства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отне­сти синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, вита­минов и др.

1 Этап сшивание днк

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК — лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК-лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» кон­цам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов.

Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4 —6 пар нуклео-тидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами:

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшивае­мых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем. Для этой цели применяют так называе­мые линкеры (или «переходники») — короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:

Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «тупым» концам

Возможно сшивание фрагментов и по тупым концам, когда концы фрагментов двунитевые:

АТГЦГГГ ЦЦЦГТАЦ

ТАЦГЦЦЦ ГГГЦАТГ

В этом случае реакция лигирования имеет биохимические особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по «лип­ким» концам.

2. Встраивание в геном

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в жи­вые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведе­нию, ее разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического ап­парата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные ак­цептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных.

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроен­ных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д.

Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов исполь­зуют плазмиды.

Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно насле­дуемые. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые моле­кулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По разме­ру они соответствуют 1 — 3 % генома бактериальной клетки.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное при­менение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, напри­мер бактериофаги.

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чу­жеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами).

1. После конструирования рекомбинант­ных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обра­ботку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие век­торную молекулу, например в среду с определенным антибио­тиком

2. Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС1₂их мем­брана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка (10%). Поэто­му среди бактерий, подвергшихся трансформации, только неболь­шая часть оказывается трансформированной.

3. Отделение ее от об­щей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клони­рования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5 — 10 бакте­рий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой коло­нии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки кото­рого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона пере­носят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген ус­тойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинан-тов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, кото­рые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют