3. Получение рекомбинантных днк

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары основа­ний разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдер­живание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»).

Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо хими­ческим путем, метят по ³²Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочечную молекулу ДНК, используемую в данном методе в качестве меченого индикатора, называют ДНК-зондом. Размеры его варьи­руют от нескольких десятков до нескольких сотен и тысяч нукле­отидов.

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов; в реакциях гибридизации с РНК .

Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. coli. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющей­ся среде.

Генетическую рекомбинацию подразделяют на два боль­ших класса: общую рекомбинацию и сайт-специфическую реком­бинацию.

1- В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными после­довательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скре­щивании и перегруппировке генов у бактерий.

2- В процессе сайт-специфической рекомбинации в обмен вступа­ют короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, распознаваемые осо­бым сайт-специфическим ферментом, что приводит к трансфор­мации распределения нуклеотидных последовательностей в гено­ме. Любые комплементарные взаимодействия между двумя гомо­логичными спиралями ДНК возможны лишь тогда, когда в одной из двух цепей происходит разрыв. К числу факторов, вызывающих такие одноцепочечные разрывы, относят: химические агенты, не­которые виды излучения, специфические белки.

Белок rec BCD присоединяется к двойной спирали ДНК с од­ного конца (5¹) и со скоростью около 300 нуклеотидов в секунду движется вдоль спирали ДНК за счет гидролиза АТР. Одновремен­но с белком движется и возникшая петля ДНК. Когда петля на спирали достигает участка, называемого сайтом узнавания (recogni­tion site), одна из цепей разрывается с освобождением небольшо­го одноцепочечного участка «ус». Возникший «ус» инициирует даль­нейшую генетическую рекомбинацию.

Общая рекомбинация

Рис.3 Обмен между 2 гомологичными спиралями.

Разрыв в одной из цепей ДНК высвобождает эту цепь, и она внедряется во вторую спираль, образуя короткий спаренный учас­ток. После начального обмена гомо­логичные нуклеотидные последова­тельности двух взаимодействующих спиралей устанавливаются в строгом соответствии одна с другой, в связи с чем происходит расширение обла­сти спаривания и быстрый обмен между спиралями. Для этого процесса разные организмы используют нео­динаковые механизмы, большинство из которых включает в качестве про­межуточного этапа обмен с перекре­щиванием цепей между двумя спи­ралями ДНК (рис. 4).

Для того чтобы восстановились две отдельные спирали ДНК и тем самым прекратился процесс спари­вания, в каждой из двух перекрещен­ных цепей должен произойти разрыв (рис. 5).

Рис.5.