5. Культура клеточных суспензий

Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жид­кую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Используя фермент, например пектиназу, получаем суспензионную культуру непо­средственно из ткани экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем уже от нее от­деляются клетки и клеточные агрегаты, в результате чего получается кле­точная суспензия.

Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо 2—3 г све­жей каллусной ткани.

Необходимым условием культивирования клеточных суспензий яв­ляется постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточ­ная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензи­онных клеток приводит к образованию каллусной ткани.

Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии аукси­нов и цитокининов, т. е. тех гормонов, которые необходимы для индук­ции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с 2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция облег­чает суспендирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в среду фермента пектиназы, который разрушает пектат кальция, склеи­вающий отдельные клетки.

Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарст­венными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изоли­рованных протопластов.

Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать их

характе­ристики: жизнеспособность, плотность клеток в суспензионной культу­ре, степень агрегированности, скорость роста.

1. Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию красите­лем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клетки не окрашиваются красителем вследствие непроницаемости для него клеточных мембран. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет.

2. Одним из основных показателей, характеризующих состояние кле­точной суспензии, является плотность клеточной популяции. Число кле­ток определяют в счетной камере Фукса — Розенталя под микроскопом после мацерации (разделения клеток).

3. Хорошо растущая суспензия имеет, как и каллусная культура, S-образную кривую роста. Обычно длительность пассажа составляет 14—16 дней.

Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток. Агрегаты не должны содержать более 10—12 клеток. Поэтому, чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют через марле­вые, найлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позво­ляет освободиться от остатков экспланта или плотных кусков каллусной ткани.

Суспензионные культуры могут быть источником ценных вторичных метаболитов, и в них могут быть новые необычные соединения, напри­мер, камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др.

Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стацио­нарной фазе роста.