3.4. Распределительная хроматография

Распределительная хроматография основывается на различии коэффициентов распределения компонентов разделяемой смеси между двумя несмешивающимися растворителями. Твердый носитель пропитывают одним из применяемых растворителей, называемым в этом случае неподвижным растворителем: так, например, пропитывают водой силикагель или используют сорбированную воду на бумаге. Исследуемую смесь растворяют во втором растворителе, называемом подвижным растворителем и пропускают раствор через колонку, а в случае применения бумаги непрерывно смачивают ее раствором в условиях, исключающих возможность даже частичного испарения растворителя.

В колоночной распределительной хроматографии промывают затем колонку чистым растворителем; при этом происходит распределение компонентов смеси и их разделение, после чего их элюируют подходящими растворителями.

В случае бумажной хроматографии, используемой главным образом для качественного анализа смесей органических веществ, полученную хроматограмму обрабатывают раствором реагента, образующего с исследуемыми веществами окрашенные соединения. В результате этого в том месте, где сосредоточилось вещество, появляется окрашенное пятно.

При выборе твердого носителя для распределительной хроматографии предпочтение следует отдавать тому, который имеет минимальное адсорбционное сродство с исследуемым растворенным веществам.

3.4.1. Хроматография на бумаге

В бумажной хроматографии неподвижным растворителем (неподвижной фазой) является вода, адсорбированная фильтровальной бумагой и всегда присутствующей в ней, носителем – фильтровальная бумага, а подвижным растворителем (подвижной фазой) – органический растворитель (или смесь растворителей), предварительно насыщенный водой.

Хроматография на бумаге, применяемая для качественного анализа органических веществ, выполняется весьма просто и к тому же с минимальными количествами веществ. Каплю раствора смеси исследуемых веществ на фильтровальную бумагу и высушивают. Затем помещают бумагу в закрытый сосуд, где она продолжительное время непрерывно смачивается органическим растворителем в условиях, исключающих его испарение.

Применяются следующие способы хроматографии на бумаге:

• Двухмерная нисходящая, в которой после проявления удаляют подвижный растворитель высушиванием и, повернув бумагу на 90⁰, производят такую же обработку другим подвижным растворителем (двухмерное проявление);

• Одномерная восходящая, в которой подвижный растворитель под действием капиллярных сил поднимается фронтом вверх по бумаге, продвигая вверх и компоненты смеси; положение пятна каждого компонента обуславливается скоростью продвижения компонента;

• Одномерная нисходящая, в которой подвижный растворитель производит разделение компонентов смеси, стекая по бумаге вниз;

• Круговая (радиальная), в которой подвижный растворитель, поступающий к центру кружка бумаги, продвигает компоненты смеси радиально по кругу.

3.4.1.1. Одномерная восходящая хроматография на бумаге

Прибором для выполнения одномерной восходящей хроматографии на бумаге (рис. 5) служит стеклянный цилиндр с протертой крышкой (или мерный цилиндр на 1 литр с резиновой пробкой), на дно которого наливается подвижный растворитель или помещается сосуд с растворителем (например, кристаллизатор). Полоса фильтровальной бумаги подвешивается на стеклянном стержне, закрепленном вверху цилиндра (на одной или двух пробках или на стеклянных стойках).

Для получения хроматограммы применяется специальная хроматографическая бумага; причем размер полосы зависит от поставленной задачи, высоты и объема цилиндра (камеры). Бумажный цилиндр удобен тем, что его можно прямо ставить на дно камеры в растворитель.

Отступая от нижнего края полосы бумаги, проводят карандашом линию, которая при хроматографировании должна быть на 2-3 см выше уровня растворителя в камере. На этой линии на расстоянии 2-2,5 см от краев бумаги отмечаются кружками диаметром 3 мм места, на которые наносят затем капли исследуемого раствора. Расстояние между каплями анализируемых проб должно быть не менее 2 см.

Капля раствора анализируемой смеси веществ (0,5-1 мг в 1 мл) наносится из капиллярной пипетки при легком прикосновении ее к отмеченным местам, чтобы раствор заполнял только отмеченную площадь и во всяком случае образующееся пятно имело бы диаметр не более 5 мм. После высыхания пятна снова наносят каплю раствора и повторяют это несколько раз (после высыхания предыдущей капли) с тем, чтобы количество нанесенного раствора составляло не менее 0,01 мл.

В среднем капилляре в диаметре 0,5 мл на конце, вытянутом из стеклянной трубки, 0,01 мл раствора занимает приблизительно 10 см по длине.

Затем бумажную полоску высушивают и подвешивают в герметически закрываемой камере таким образом, чтобы она не касалась стенок и конец ее погружался в налитый на дно растворитель на расстоянии 2 – 3 см от черты, на который наносились капли раствора; бумажный цилиндр ставят на дно цилиндра в растворитель, соблюдая те же условия.

Рекомендуется помещать камеру в другой сосуд (или кожух) большего размера или закрывать колпаком (из бумаги, плотной материи и т.п.) для защиты от воздушных потоков и обусловливаемой ими неравномерности нагревания, следствием чего может являться неравномерное проявление хроматограммы.

Закрытую камеру оставляют стоять до тех пор, пока фронт растворителя не поднимется почти до верха бумажной полоски (12 – 18 часов), а затем вынимают хроматограмму и карандашом отмечают на ней верхнюю границу фронта растворителя. После высушивания хроматограмму опускают на несколько секунд в ванночку с раствором реагента – индикатора или опрыскивают им из пульверизатора (хроматограмму, полученную на бумажном цилиндре, перед проявлением следует развернуть).

Для развития окраски пятен хроматограмму после опрыскивания помещают на 5 минут в сушильный шкаф, нагретый до 90 – 100⁰, или оставляют на несколько часов в темноте между листами фильтровальной бумаги, после чего обводят карандашом окрашенные пятна, чтобы точно отметить их положение.

Идентификация каждого компонента смеси по окрашенному пятну производится на основании расчета величины коэффициента распределения (Rf). Для вычисления Rf измеряют:

А) расстояние х (в мм), пройденное веществом, то есть расстояние от линии нанесения вещества («линия старта») до центра пятна, и

Б) расстояние у (в мм), пройденное растворителем от той же «линии старта» до фронта растворителя.

Значение Rf вычисляется по формуле

Rf = x / y

По таблицам Rf индивидуальных веществ в соответственных системах растворителей, опубликованным в литературе, находят, какому веществу соответствует найденная величина.

Другим и притом весьма надежным способом идентификации компонентов смеси при помощи бумажной хроматографии является «способ свидетелей». Поэтому способу на расстоянии 3 – 4 см в ту и другую сторону от капли смеси на той же «линии старта» наносят капли «свидетелей». После хроматографирования и выявления пятен сопоставляют положение пятен компонентов исследуемой смеси с положением пятен заведомо известных веществ – «свидетелей».