3.1. Адсорбционная хроматография

В адсорбционной хроматографии разделение компонентов смеси производится следующим образом: раствор смеси веществ проводят через вертикальную колонку с адсорбентом, а затем медленно пропускают через нее чистый растворитель. При промывании колонки растворителем компоненты смеси продвигаются вниз по колонке с различной скоростью, обусловливаемой степенью их сродства к адсорбенту. Благодаря этому происходит распределение растворенных веществ по высоте колонки в виде колец или зон, то есть происходит проявление хроматограммы.

Последующая обработка хроматограммы может производиться двумя способами:

• Адсорбированные вещества элюируют, то есть вымывают растворителями из колонки и собирают в виде отдельных фракций растворов (элюатов).

• Отсасывают полностью растворитель из колонки (в вакууме), вынимают сухой адсорбент (выталкивая столбик адсорбента или разрезая по зонам колонку с адсорбентом) отделят образовавшиеся зоны и экстрагируют из каждой адсорбированное вещество подходящим растворителем.

Когда при элюировании хроматограммы обнаруживается, что растворитель уже не вымывает заметных количеств вещества – то заменяют его другим. А обычно растворители, применяемые для элюирования нейтральных соединений, чередуют в следующем порядке: легкий петролейный эфир (точка кипения ниже 80 градусов), бензол, хлороформ, эфир, ацетон, спирт, уксусная кислота. Обычно в менее полярном растворителе адсорбированное вещество удерживается на адсорбенте более прочно и элюирование часто достигается при замене менее полярного растворителя более полярным. Большинство адсорбированных веществ удаляется метиловым или этиловым спиртом. Часто является достаточным добавление растворителю этих спиртов в количестве 0,2 – 0,5%.

Аппаратура, используемая в адсорбционной хроматографии, проста и некоторые общие типы ее показаны на рисунке 1.

На рисунке 1а трубка для адсорбента заканчивается внизу шлифом (или резиновой пробкой), соединяющим ее с пришлифованной (или простой) воронкой, вставляемой в колбу для отсасывания: в низ трубки вставляется пробка из хлопчатой или стеклянной ваты, или фильтрующая пластинка (фарфоровая или стеклянная сетка или крупнопористой стеклянный фильтр), в которой удерживается адсорбент. В таком приборе можно легко выталкивать столбик адсорбента, а раствор может протекать через колонку и при слабом отсасывании.

На рисунке 1б изображен прибор, позволяющий проводить хроматографирование при несколько повышенном давлении.

При жидкостном хроматографировании и элюировании зон в обычных условиях может применяться обыкновенная бюретка с тампоном из хлопчатой или стеклянной ваты для удержания адсорбента (рис. 1в).

Адсорбенты, применяемые для жидкостной хроматографии весьма разнообразны. Наибольшее применение находит активированная окись алюминия, используемая для разделения нейтральных и основных веществ. Силикагель применяется для хроматографирования кислых веществ. Окись магния, сернокислый магний и углекислый магний, а также гидрат окиси кальция и углекислый кальций, глюкоза, лактоза и др. также используются в хроматографии в качестве адсорбентов.

Обычно применяется от 20- до 30-кратного весового количества адсорбента по отношению к весу смеси, подлежащей хроматографическому разделению, и трубка, у которой отношение диаметр: высота слоя адсорбента ~ 1 : 20.

Наполнение адсорбционной колонки. Приступая к наполнению колонки, следует помнить, что удовлетворительные результаты при хроматографировании получаются лишь в тех случаях, когда колонка наполнена адсорбентом вполне однородно.

Наполнение колонки производится адсорбентом с величиной частиц 60 – 80 меш и выполняется по одному из следующих способов.

Сухой способ наполнения. Колонку промывают горячей хромовой смесью, затем дистиллированной водой и высушивают. В низ колонки помещают рыхлую пробку из ваты или фильтрующие пластинки, устанавливают колонку вертикально и небольшими порциями вносят адсорбент. Первая порция адсорбента (обычно 3 – 4 см по высоте колонки) должна вдвое превышать каждую из последующих. Каждую порцию адсорбента сначала уплотняют энергичным постукиванием выше слоя его резиновой пробкой, надетой на стеклянную палочку, а затем прессуют ровно обрезанной палочкой, либо стеклянным или деревянным пестиком, если диаметр трубки превышает 10 мм. Около 1/5 –1/3 части трубки над адсорбентом оставляют незаполненной.

Затем адсорбент увлажняют растворителем, снова прессуют пестиком и тщательно выравнивают поверхность адсорбента под слоем растворителя. Выравнивание поверхности абсорбента необходимо по тому, что иначе образуются неровные полосы, причем неровность их будет еще более увеличиваться при промывании.

После этого на расстоянии 1 см от поверхности адсорбента помещают рыхлую пробку из ваты, которая должна предохранять поверхность адсорбента от возможных нарушений.

В колонке, подготавливаемой к работе таким путем, адсорбент с момента увлажнения должен все время оставаться покрытым слоем растворителя; после установки над адсорбентом пробки из ваты высота слоя растворителя над адсорбентом должна быть не менее 5-7 см.

Влажный способ наполнения.

• Адсорбент и растворитель помещают в делительную колонку, снабженную хорошо действующей механической мешалкой. В делительную воронку наливают растворитель и всыпают адсорбент. При энергичном размешивании образуется суспензия адсорбента в растворителе, которой дают затем стекать в чистую сухую колонку, не прекращая размешивания и все время постукивая по колонке широкой стороной линейки, чтобы облегчить удаление пузырьков воздуха. После этого смывают растворителем адсорбент со стенок колонки.

Адсорбент, осаждающийся под действием силы тяжести, образует плотно упакованный столбик. На расстоянии 1 см от поверхности адсорбента помещают рыхлую пробку из ваты. Слой растворителя над адсорбентом должен быть не менее 5-7 см высоты.

При таком и нижеописываемом способе заполнения обычно получается ровная поверхность адсорбента.

• Бюретку или стеклянную трубку, снабженную краном, заполняют наполовину растворителем и проталкивают рыхлую пробку из ваты через растворитель в низ колонки стеклянной палочкой. Затем небольшими порциями вносят адсорбент, постукивая по бюретке, как указано выше. Новую порцию адсорбента вносят только после того, как осядет предыдущая. Затем смывают стенки бюретки растворителем, помещают над адсорбентом пробку из ваты, как описано выше, и доливают столько растворителя, чтобы слой его над адсорбентом был высотой 5-7 см.

Хроматографирование

В наполненную адсорбентом колонку вставляют на пробке капельную воронку и осторожно приливают из нее раствор смеси веществ в подходящем растворителе. Когда раствор почти полностью протечет через колонку с адсорбентом, вливают в воронку чистый растворитель и начинают проявление хроматограммы.

Если вещества окрашенные, то за их разделением следят по образованию окрашенных полос, и если полосы достаточно хорошо разделились, то проявление прекращают и приступают либо к механическому разделению хроматограммы, либо к элюированию.

Если предстоит механическое разделение хроматограммы, то дают растворителю полностью стечь из колонки, выталкивают деревянным пестиком весь столбик адсорбента на стекло и разрезают его ножом по зонам (иногда разрезают по зонам всю трубку с хроматограммой). Затем адсорбированное вещество каждой зоны экстрагируют подходящим растворителем, отфильтровывают адсорбент и, выпаривая растворитель выделяют вещество.

Если предстоит элюирование хроматограммы, то продолжают прибавление того же растворителя, отбирая определенное количество фракций раствора и следя за ходом элюирования по весу остатка, оставшегося после испарения растворителя.

Если растворитель больше не элюирует адсорбированное вещество, то заменяют его другим, более действенным.

В случае разделения бесцветных веществ элюирование становится необходимостью, так как лишь в некоторых случаях можно определить зоны адсорбированных веществ, прибегая к облучению УФ – светом.