3.Силова мікроскопія зонда Кельвіна

Технологія мікрочіпів широко застосовується в генетичних і молекулярно-біологічних дослідженнях. В даний час в микрочипах взаємодія між цільової ДНК (що цікавить нас ДНК) і іммобілізованим ДНК-зондом (пришитою до поверхні чіпа одноланцюжкові молекулою ДНК з відомою послідовністю) виявляють за допомогою флуоресцентної мітки. Сучасні методи створення мікрочіпів дозволяють наносити різні ДНК-зонди на підкладку з фотолітографії точністю, однак методи зчитування подібної точністю не мають, тому на практиці використовуються комірки розміром близько 10 мкм.

Технологія візуалізації поверхні, відома як метод зонда Кельвіна (Kelvin probe force microscopy, KPFM), дає можливість вивчати взаємодії між біомолекули, а в поєднанні з методом dip-репнанолитографии (DPN) являє собою аналог технології ДНК-мікрочіпів. KPFM дозволяє надійно детектувати сигнал при розмірах комірки 250 нм. Таким чином, мова йде вже про наночипах, в яких щільність осередків в тисячу разів більше, ніж у сучасних микрочипах.

У методі KPFM вимірюється розподіл поверхневого потенціалу в досліджуваному субстраті. Багато біологічні молекули мають у своїй структурі заряджені ділянки, наприклад такі, як негативно заряджений сахарофосфатная основа молекули ДНК. При формуванні высокоспецифичных комплексів між молекулами відбувається перерозподіл щільності заряду. Вивчаючи зміна потенціалу поверхні зразка, можна детектувати взаємодія між біомолекули.

Asher Sinensky і Angela Belcher з Massachusetts Institute of Technology (США) продемонстрували, що KPFM є зручним і надійним методом зчитування сигналу з білкових або ДНК-наночипів. До переваг методу відносяться: висока роздільна здатність (< 10 нм), висока чутливість (< 50 нМ), висока швидкість сканування зразка (> 1100 мкм/с), можливість розрізняти специфічні та неспецифічні взаємодії між молекулами. Безконтактний метод і не вимагає використання міток, що особливо важливо для біологічних систем.

Представимо дві модельні системи, що імітують основні типи біологічних чіпів. У першому випадку вивчали взаємодія молекули біотину і глікопротеїну авідіна, аналогічне взаємодії «антитіло-антиген». Біотин був іммобілізований на золотий підкладці методом DPN. Зміна потенціалу поверхні після додавання авідіна чітко показує, що сталося зв'язування (рисунок 4).

Рисунок 4 Зміна потенціалу поверхні після додавання авідіна.

У другому випадку вчені досліджували застосування методу KPFM для детектування ДНК-гібридизації - явища, що лежить в основі ДНК-чіпів. Як ДНК-зондів вчені використовували 15-нуклеотидні одноланцюжкові ДНК, що містять фрагменти генів сибірської виразки в одному випадку і малярії в іншому. Згідно очікуванням, в обох випадках спостерігалося подвоєння сигналу при додаванні зразка ДНК, комплементарного ДНК-зонду (рисунок 5), і не спостерігалося у разі некомплементарного (рисунок 6).

За результатами цих досліджень ми можемо спостерігати візуальну форму поверхні тих чи інших матеріалів яка відповідає геометричним розмірам та рельєфу досліджуваного зразка з мінімальними спотвореннями. Цей метод є провідним методом при дослідженні мікроорганізмів або вірусів манометричних розмірів, де вирішальною задачею мікроскопії є дослідження найменших особливостей мікроорганізмів.

Рисунок 6 Випадок не комплементарних зв’язків

Рисунок 5 Подвоєння сигналу при комплементарному зв’язуванні зрвзка та ДНК-зонда

Застосовуємий в даний час Метод Зонда Кельвіна ґрунтується на двухпрохідній методиці. У першому проході визначається рельєф поверхні зразка з використанням преривисто-контактного методу (коливання кантілевера порушуються механічно). На другому проході цей рельєф відстежується, при проходженні над зразком на певній висоті, для визначення поверхневого електричного потенціалу Ф(x). Протягом цього другого проходу коливання кантілевера порушуються не механічно, а електрично шляхом застосування до зонду напруги зсуву Vtip яке містить статичні і динамічні компоненти:

Vtip=Vdc + Vac sin(wt)

Результуюча ємна сила Fcap між зондом і поверхнею, що знаходиться при Vs дорівнює:

Fcap =(1/2) (Vtip - Ф(x))2(dC/dz),

де C(z) є ємністю зонд-зразок.

Сила Fcap w = (dC/dz(Vdc- Ф(x)Vac)sin(wt), діюча на першій гармоніці призводить до відповідних коливань кантілевера. Система зворотного зв'язку змінює змінну складову потенціалу зонда Vdc поки w компонента коливань кантілевера (і, відповідно, w компонента сили зонд-зразок) не зникне, тобто поки Vdc (x) не стане рівною Ф(x). В результаті розподіл Vdc (x) буде відображати розподіл поверхневого потенціалу поверхні зразка. Якщо на зонд не подається постійне переміщення, то це розподіл представляє розподіл Контактної Різниці Потенціалів.

Рисунок 7. Зображення графіту отримане методом зонда Кельвіна

На рисунку 7 показана опографія та зображення поверхні высокоориентированного піролітичного графіту (ВОПГ), отриманий методом зонда Кельвіна. Розміру скана 6 мкм.