Вопросы для повторения

1. Что необходимо учитывать при подготовке образцов для исследования методом спектрального рентгеновского микроанализа.

2. Дайте характеристику методам препарирования образцов для подготовки к спектральному рентгеновскому микроанализу.

Приложение 3. Исследование морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи рентгеновского микроанализа

***

Методом электронно-зондового микроанализа определена концентрация элементов (К, Na, C1) в миоците криосрезов папиллярной мышцы изолированного сердца крысы.

Исследования проведены на изолированном сердце крыс линии Wistar (самцы массой 350-400 г). В течение суток до эксперимента животные лишались пищи без ограничения доступа к воде. После декапитации выделяли сердце, закрепляли аортой на канюлю и перфузировали по Ланген-дорфу при 38°С или 8°С (гипотермия) раствором Тироде. В эксперименте использовали протоколы глобальной ишемии сердца и ишемии в условиях аноксической перфузии без глюкозы. По окончании перфузии вскрывали полость левого желудочка изолированного сердца и выделяли папиллярную мышцу. В работе проводилось исследование перфузии с временными промежутками - 15, 30, 45, 60 мин. Выделенная ткань папиллярной мышцы монтировалась на держатель, замораживалась в жидком пропане (-188°С) и помещалась в камеру криостата (-30°С) с последующим изготовлением криосрезов толщиной 10 мкм. Криосрезы помещали в охлажденный медный контейнер, который переносили в парах жидкого азота на столик вакуумной установки MIKRO BA (BALZERS), где криосрезы лиофилизировались 12 ч в вакууме 5·10^-5 мм рт.ст. при постепенном повышении температуры столика от -190°С до комнатной температуры. Высушенные криосрезы монтировались на медную сеточку для электронного микроскопа и в вакуумной камере установки JEE-4B (JEOL) на их поверхность наносили слой углерода путем термического распыления. Измерение внутриклеточной концентрации элементов проводили методом электронно-зондового микроанализа. В основе метода лежит регистрация интенсивности характеристического рентгеновского излучения, ионизируемых в образце ускоренными электронами зонда. Для рентгеновского микроанализа применялся сканирующий электронный микроскоп-микроанализатор JSM-U3 (JEOL). Электронно-зондовый микроанализ проводился при ускоряющем напряжении электронов 25 кВ, токе электронов зонда 5 нА и времени накопления импульсов рентгеновского излучения 40 с. Наиболее интенсивная К_α-линия характеристического спектра анализируемого элемента выделялась на кристалл-анализаторе PET (калий, хлор) и RAP (натрий). Юстировку спектрометров рентгеновского излучения проводили на минералах NaCl и KAlSi₃O₈. Морфологию криосреза наблюдали в режиме вторичных электронов.

В результате анализа результатов было установлено, что глобальная ишемия вызывает в мышечной клетке дефицит калия (94 ± 2 мМ), накопление в цитоплазме натрия (72 ± 4 мМ) и хлора (42 ± 1 мМ) по сравнению с интактной клеткой (122 ± 2 мМ; 36 ± 1 мМ; 24 ± 1 мМ). При ишемии в условиях аноксической перфузии без глюкозы наблюдается плавное уменьшение концентрации калия в клетке до 54 ± 2 мМ при поддержании уровня внутриклеточного натрия (40 ± 1 мМ) и хлора (26 ± 1 мМ). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что на стадии ранней ишемии последовательно активируются мембранные механизмы ионного транспорта, специфичные для гипоксии. Предполагается, что в ишемических условиях активируется и Na/K-АТФаза.