Результаты и обсуждение

У четырёх из семи исследованных эмбрионов трансплантат был обнаружен в правой части нервной трубки – там куда и пересаживали (см. Рис3.), у двух – трансплантат находился под нервной трубкой, рядом с хордой, у одного эмбриона трансплантата найдено не было (табл.1).

У тех эмбрионов, в нервную трубку которых трансплантат был встроен нормально, были пересажены участки нервной трубки с уровней следующих сомитов: 4-5, 13-14, 14-15 и 16-17. С уровней сомитов 5-6 и 20-22 были пересажены участки нервной трубки у эмбрионов с неправильно встроившимся трансплантатом (см. рис. 2).

Препараты эмбрионов с неправильно встроившимся трансплантатом, принимались во внимание, так как мы допускали возможность того, что клетки нервного гребня могут сориентироваться и найти правильные пути своей миграции, встроившись в структуры, в которые вносят вклад.

Ни в одном из скелетных элементов, исследованных нами, не было обнаружено клеток перепела. (см. рис. 5, 6, 7, 8) Однако то, что нервный гребень в трансплантатах присутствовал, подтверждается наличием перепелиных клеток в миелиновой оболочке периферических нервов эмбрионов со встроившимся трансплантатом (см. рис. 4). Что касается клеток чувствительных ганглиев, которые являются производными нервного гребня, нам не удалось установить какими клетками, куриными или перепелиными они сформированы в районе трансплантации. Дело в том, что в клетках чувствительных ганглиев, как в куриных, так и в перепелиных, ядра содержат очень большие ядрышки, что не даёт идентифицировать принадлежность этих клеток курице или перепелу.

Так как мы пересаживали фрагменты нервной трубки, вместе с медиальными кусками сомитов, в препаратах всех эмбрионов, в которых произошло встраивание нервной трубки клетки перепела были найдены в эпаксиальной мускулатуре. Однако контаминация мышечной ткани клетками перепела в нашем случае не страшна, так как эти клетки мигрируют из медиальной части сомита, которая даёт начало склеротому, а среди скелетных производных склеротома элементов плечевого пояса нет. Клетки латеральной половины сомитов могут мигрировать в хрящ лопатки, но так как в нашем случае в лопатке клеток перепела найдено не было, латеральные части сомитов не переносились нами вместе с фрагментом перепелиной нервной трубки.

У двух эмбрионов клетки перепела были найдены также в позвоночнике – у одного в нейральных дугах, тогда, как у другого – в теле позвонка под хордой. Скорее всего это является результатом контаминации трансплантата клетками сомитов.

Таким образом, мы пришли к выводу, что туловищный нервный гребень у птиц, по крайней мере с тех уровней, на которых мы проводили операции, не мигрирует в хрящи лопатки и коракоида и таким образом не вносит вклад в эти структуры.

Хотя, конечно, наши результаты являются только предварительными, хотя бы потому, что не все участки нервной трубки были пересажены, они согласуются с результатами, полученными моим научным руководителем, Е. Б. Малашичевым, который проводил схожие эксперименты на курице при трансплантации ткани от трансгенных эмбрионов, экспрессирующих ген зелёного флуоресцентного белка (GFP) во всех клетках к эмбрионам дикого типа. В этих экспериментах были использованы 34 химерных эмбриона, из которых выжило 18, и проанализировано 7 эмбрионов, у которых были пересажены участки нервной трубки с уровня границы заднего и спинного мозга по уровень 24 сомита. В отличие от моих трансплантаций, в данном случае пересаживались полные отрезки нервной трубки длинной четыре-шесть сегментов, так что в сумме они составляли полную длину с прехлёстами от заднего мозга и передней границы плечевого пояса по уровень 24 сомита (т.е. каудальнее конца лопатки). Кроме того, каждый трансплантат захватывал участок нервной трубки на уровне каудальнее от самого молодого из вновь сформировавшихся сомитов, т.е. участок из которого клетки нервного гребня с меньшей вероятностью успели мигрировать до начала операции.. Хотя эти данные также носят предварительный характер, вклад клеток нервного гребня в пояс передних конечностей не обнаружен и в таком случае, несмотря на то, что спинальные ганглии и Швановские клетки миелиновых оболочек нервов оказались зелёными. (Малашичев Е.Б., персональное сообщение, см также рис. 9).

Если у куриных эмбрионов действительно нет вклада нервного гребня в плечевой пояс, можно сделать вывод, о том, что клетки нервного гребня в плечевом поясе млекопитающих – это, возможно, их эволюционное приобретение. В пользу этого говорит и тот факт, что в лопатке млекопитающих клетки нервного гребня были обнаружены в гребне и акромионе, т.е. в структурах, которые считаются морфологическими приобретениями млекопитающих. Если это верно, то в эволюционном ряду наблюдается следующая тенденция: у ранних позвоночных появляется большое количество костных производных нервного гребня (дермальные окостенения), тогда, как с исчезновением дермальных окостенений, роль нервного гребня в формировании костей сильно уменьшается только до костей черепа, а у млекопитающих, роль нервного гребня в формировании скелета вторично увеличивается (вклад в плечевой пояс).

Как уже было отмечено, наши выводы о том, что в лопатке и коракоиде нет клеток из нервного гребня, являются предварительными, так как существуют некоторые нюансы, требующие дополнительной проверки.

Во-первых: миграция может происходить из тех отделов нервного гребня, которые у нас пересадить не удалось (из-за смертности эмбрионов или из-за того, что трансплантат не приживался, так как сильно изгибался и «выскакивал» из нервной трубки реципиента). Из-за изгибания трансплантата, вырезанного из отдела заднего мозга, у нас, к сожалению, так и не получилось сделать нормальной пересадки этого отдела. Так как отдел заднего мозга обладает высоким скелетогенным потенциалом, он является важным кандидатом на роль источника скелетогенной мезенхимы и для пояса передних конечностей. Не были пересажены также фрагменты с уровней 1-7 сомитов, 7-12, 18-19 и 23-24. Фрагменты с уровней сомитов 5-6, 20-22 встроились в реципиенте неправильно, что могло нарушить миграцию клеток из нервного гребня пересаженного перепелиного трансплантата. Таким образом нам удалось пересадить только примерно половину того, что мы запланировали (основная причина этого – мало времени), и пересадка оставшейся части – основание для продолжения нашей работы.

Во-вторых: возможно мы не увидели клеток нервного гребня перепела в скелетных элементах пояса передних конечностей куриного эмбриона из-за того, что в пояс конечностей мигрирует небольшое число клеток из нервного гребня, и они занимают крайне малую часть этих костей. Так как метод окрашивания клеток по Фёльгену не очень надёжен для определения происхождения единичных клеток (куриные или перепелиные), в будущем мы планируем окрашивать препараты курино-перепелиных химер с помощью антител против перепелиных антигенов.

В-третьих наши результаты могут быть следствием того, что трансплантации проводились на стадиях, когда клетки из соответствующих участков нервного гребня, формирующие костную ткань уже мигрировали Чтобы исключить такую вероятность в дальнейшем необходимо провести операции по пересадке участков нервной трубки, из которых миграция нервного гребня ещё не произошла. Этого можно достигнуть, пересаживая незамкнувшиеся участки нервной трубки, однако пересадка этих участков гораздо более трудоёмка. Тот факт, что вместе с фрагментом нервной трубки мы переносили части сомитов, в некоторой степени является для нас даже позитивным, так как миграция клеток, выселяющихся из нервного гребня осуществляется по стенкам нервной трубки и по сомитам. Таким образом на кусках сомитов, которые мы «прихватывали» вместе с нервной трубкой могли быть клетки нервного гребня, выселившиеся раньше тех стадий, на которых проводились операции Это уменьшает вероятность того, что мы упускали клетки нервного гребня, мигрировавшие до операции.

В дальнейшем нами планируется провести серии операций, которые позволили бы точно определить значение вклада клеток нервного гребня в пояс передних конечностей у птиц. Во-первых, необходимо сделать дополнительные пересадки нервной трубки на всём протяжении от района заднего мозга до уровня 24-го сомита, во-вторых, возможно проведение трансплантаций участков незамкнувшейся нервной трубки. Также возможно применение антител к антигенам перепела для более точного выявления клеток из перепелиного трансплантата, а также антител к антегенам клеток нервного гребня, для определения точности трансплантации. Дополнительно возможна также работа с трансгенными эмбрионами курицы, несущих ген зелёного флуоресцирующего белка GFP или использование электропорации плазмиды GFP в нервную трубку эмбрионов курицы дикого типа, с дальнейшим выявлением GFP на крио или парафиновых срезах непосредственно под флуоресцентным микроскопом или после предварительного усиления сигнала с помошью антител против зелёного флуоресцентного белка.