Цель работы

Цель работы состояла в выяснении - есть ли клетки – производные нервного гребня в хряще (а на самом деле и соединительной ткани в местах прикрепления мышц) пояса передних конечностей птиц.

Вклад клеток нервного гребня в лопатку у птиц предполагается (McGonnell, 2001), но ещё никем достоверно не показан. Также он известен для млекопитающих (Matsuoka et al., 2005), у которых производные нервного гребня обнаруживаются в составе акромиального отростка и гребня лопатки. Поэтому одна из задач работы заключалась в том, чтобы проверить - является вклад нервного гребня в лопатку уникальным для млекопитающих или же он универсален и имеет место также и у других позвоночных животных, в частности, у птиц, принадлежащих совершенно другой филогенетической ветви современных амниот.

Исследование эмбриональных источников ключицы и прокоракоида у птиц проводилось на курино-перепелиных химерах ещё в 1977 году (Chevallier et al., 1977), результатом которого был вывод, что ключица и прокоракоид происходят из боковой пластинки мезодермы. В то же время, трансплантации презумптивного нервного гребня не проводились, что оставляло неопределённость относительно эмбрионального происхождения этих элементов пояса. В то же время, производные нервного гребня действительно являются одной из главных составляющих как дермальной, так и эндохондральной частей ключицы млекопитающих (Matsuoka et al., 2005). Поэтому второй задачей нашего исследования было выяснение роли клеток нервного гребня в формирование ключицы птиц. Кроме этого, мы также ставили перед собой задачу определить, имеются ли клетки- производные нервного гребня в коракоиде и грудине.

Материал и методика

Основным методом, применяемым в нашей работе были гомотопные гетеротрансплантации фрагментов нервной трубки от перепелиного эмбриона куриному. Перепелиные клетки визуализировались в курином эмбрионе на парафиновых срезах, окрашенных по Фёльгену (LeDouarin, 1969).

Курино-перепелиные химеры

Трансплантации проводили на эмбрионах, находящихся на стадиях 10-14 (10–22 сомита). Для этого оплодотворённые яйца помещали в инкубатор на 1,5 суток, при температуре 38 С. После инкубации в яйцах определяли местоположение зародыша на овоскопе (можно было бы написать: визуализировали с помощью кандалирования – шутка). Затем над зародышем випиливали прямоугольное окно в скорлупе, размером ок. 1 кв. см. Края этого окна обмазывали парафином, и эмбрион поднимали в пропиленное окно путём добавления 1-2 мл физраствора (раствор Локка – 2М раствор NaCl, KCl и CaCl2), содержащий антибиотики (концентрация - 0,02-0,04 мг/л пенициллина и 0,02-0,04 мг/л стрептомицина). Парафин, обладающий водоотталкивающими свойствами, приводил к формированию над окном в скорлупе линзы из физраствора, под которой находился эмбрион, что позволяло нужным образом подсвечивать и контрастировать эмбрион. С помощью пинцетов и вольфрамовых игол, заточеных электролитически, с эмбриона снимались яйцевые оболочки и в некоторых случаях - провизорные (хорион и амнион), если к моменту операции таковые формировались и закрывали часть эмбриона. Также с помощью вольфрамовых игол вырезали фрагмент нервной трубки. Операции проводили на отрезке нервной трубки, начиная от заднего мозга и заканчивая 24-м сомитом. На разных кранио-каудальных уровнях, вырезали фрагменты правой половины нервной трубки длиной в 2-3 сомита.

Подготовка трансплантата фрагмента нервной трубки перепелиного эмбриона проводили иначе. Так как не было необходимости проводить операцию на эмбрионе в яйце, мы вырезали эмбрион с поверхности желтка с помощью специальных ножниц и закрепляли его на дне чашки Петри, залитом агарозой. Вырезание фрагмента нервной трубки проводилось также и с тех же участков, что и для соответствующего куриного эмбриона, служащего в качестве реципиента для подготовленного трансплантата (см. рис.1). Далее трансплантат с помощью пипетки переносили в куриное яйцо и с помощью вольфрамовых иголок загоняли в проделаное ранее отверстие. Вся операция происходила под микроскопом при увеличении в среднем в 20 раз. При операциях выяснилось, что отделить нервную трубку от сомитов очень сложно, и практически на всех трансплантатах присутствовали группы клеток дорзо-медиальных частей эпителизованных сомитов, которые в норме дают эпаксиальную мускулатуру. Однако как было показано в работе Ванга с соавторами (Wang et al., 2005), пластинка лопатки состоит из клеток дорзо-латеральной частей грудных сомитов, поэтому в плечевом поясе химерного эмбриона клеток сомитов быть не должно. Также в процессе операции оказалось, что после вырезания трансплантата из реципиента – трансплантат имеет особенность изгибаться, что сильно затрудняет его помещение в подготовленную рану в теле реципиента. Особенно сильно изгибается половинка нервной трубки, вырезанная из заднего мозга.

После операции с помощью шприца из яйца откачивали 1.5-2 мл белка, чтобы желток с эмбрионом опустился из окна вниз под скорлупу. Затем отверстия в скорлупе заклеивали пластырем, и яйца помещали в инкубатор ещё на 4-5 суток до достижения эмбрионами стадии 30-32 по Гамбургеру и Гамильтону (6,5-7 суток развития). После этого эмбрионов извлекали из яиц и фиксировали в жидкости Серра (6 частей 96% спирта : 3 части формалин : 1 часть ледяной уксусной кислоты).

Гистологические методы

Эмбрионов из фиксатора Серра проводили по спиртам (70% этонал-80% этанол-90% этанол-100% изобутиловый-100% изобутиловый) по 1 часу в каждом. Затем по парафинам (изобутанол/парафин: 2/1-1/1-1/2-100% парафин-100% парафин) также по 1 часу в каждом. После заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 10 мкм. Окраска производилась по Фёльгену. Действующим веществом в этом методе окраски является реагент Шиффа, который связывается с ДНК. Таким образом, хорошо визуализируется гетерохроматин. Так как в клетках перепела гетерохроматина больше, чем в клетках курицы и организован он в крупные компактные ядрышки, клетки трансплантата можно отличить от клеток хозяина-куриного эмбриона, у кеоторого гетерохроматин более рассеян по ядру. Препараты также подкрашивали в 1% растворе светлого зелёного на 95% этаноле для выявления структуры ткани.

Всего было прооперировано 29 эмбрионов. Выжили 19, из которых 7 были порезаны и покрашены.

На препаратах оценивался вклад клеток перепела в лопатку и прокоракоид путём анализа гистологических картин и классификации клеток на куриные и перепелиные.