Біоінформатика

Велика кількість послідовностей (у тому числі, повних послідовностей геномів), які вже встановлені та продовжують накопичуватись, створює завдання їх збереження та аналізу. Зрозуміло, що таке завдання (яке постає вже при порівнянні послідовностей окремих клонованих фрагментів з метою з'ясувати нуклеотидну послідовність геному) може бути виконаним лише за допомогою комп'ютерів. Біоінформатика – галузь, що пов'язана з вирішенням зазначених проблем, є сьогодні невід'ємною складовою частиною молекулярної біології.

Найбільші загальнодоступні через інтернет бази даних нуклеотидних та амінокислотних послідовностей створено у Європейскій Лабораторії Молекулярної Біології (EMBL Sequence Data Base) та Національних Інститутах Здоров'я США (GenBank). На відповідних порталах розміщено також програмні засоби порівняння послідовностей, пошуку промоторів, стартових точок транскрипції, інтронів та екзонів, визначення білкових послідовностей з послідовностей нуклеотидів тощо. Серед баз даних on-line слід згадати також бази даних просторових структур білків (Protein Data Bank) та нуклеїнових кислот (Nucleic Acid Database).

На основі біоінформатичного аналізу можна встановити, наприклад, функціональне значення невідомого щойно клонованого гена по його гомології з відомим геном іншого організму, структуру гена (знайти промотор, екзони, точки термінації транскрипції), структурно-функціональні особливості нових білків, функціональні зв'язки між різними білками та генами, філогенетичні стосунки між різними таксонами. Завдяки розвитку біоінформатики з'явилась можливість, у доповнення до результатів, що отримують in vivo та in vitro, вирішувати різноманітні проблеми просто за допомогою комп'ютера – in silico.

Експрессія рекомбінантних білків

Оскільки переважна більшість білків синтезується клітиною у невеликих кількостях, просте виділення цих білків з метою їх дослідження є практично неможливим. Технології рекомбінантних ДНК дають рішення цієї проблеми. Ген, що кодує даний білок, можна клонувати, вбудувати, наприклад, у бактеріальну плазміду, і змусити бактеріальну культуру продукувати цей білок. Виділення та очистка білка з культури біохімічними методами вже не є принциповою проблемою, зважаючи на його велику кількість.

Рис. 11.9. Експресія білка в бактеріальній клітині. lac-Промотор – промотор лактозного оперона, IPTG – синтетичний індуктор оперона.

Одну з найпростіших схем експресії білка в E. сoli зображено на рис. 11.9. Зрозуміло, що еукаріотичний ген не має сенсу вводити в прокаріотичну клітину – прокаріоти не мають системи сплайсингу. Тому беруть лише кодуючу частину гена, яку можна отримати з бібліотеки клонів кДНК. Використовуючи придатну рестриктазу та лігазу, потрібну кДНК вбудовують у плазміду поряд із промотором – наприклад, лактозного оперона (див. розділ 5). Здійснюють трансформацію рекомбінантної плазміди у бактеріальні клітини, до бактеріальної культури додають синтетичний індуктор lac-оперона IPTG. Промотор активується, і здійснюється транскрипція гена та трансляція білка.

Більш ефективна двостадійна система експресії використовує промотор РНК-полімерази бактеріофага Т7. У бактеріальному геномі ані таких полімераз, ані відповідних промоторів немає. В клітину вводяться два плазмідні вектори: один містить lac-промотор і ген РНК-полімерази Т7, інший – сильний промотор полімерази Т7 разом із геном білка, що має бути експресований. IPTG індукує експресію полімерази, яка зв'язується тільки з промотором у складі другої плазміди (інших промоторів немає) та забезпечує синтез великої кількості білка.

Вивчення структури й особливостей функціонування багатьох білків було б просто неможливим без такої штучної експресії. Крім того, використання рекомбінантних ДНК для експресії білків відкриває принципово нові можливості: послідовність ДНК можна практично як завгодно змінити, і отримати мутантну форму білка. До білкового гена можна пришити ген іншого білка, що буде виконувати роль мітки. Частину гена, що відповідає частині білка (наприклад, структурному домену) можна вилучити, й отримати редукований білок чи окремий домен для структурних досліджень. Будь-який нуклеотид можна замінити на інший методами спрямованого мутагенезу, завдяки чому отримати білок з амінокислотною заміною. Такі підходи мають велике значення для вивчення механізмів активності ферментів, специфічного впізнання білками інших молекул тощо.

Одну з можливостей замінити нуклеотид за допомогою ПЛР ілюструє рис. 11.10. У якості матриці для ампліфікації використовується плазміда, що містить послідовність-мішень. Реакція проводиться у двох варіантах: з різними наборами праймерів. Один з двох

Рис. 11.10. Спрямований мутагенез за допомогою ПЛР. Послідовність-мішень зафарбована блакитним кольором.

праймерів у кожному наборі містить замінений нуклеотид, як показано на рисунку. Результатом ампліфікації є лінійні молекули ДНК із заміненою нуклеотидною парою. Об'єднання продуктів ампліфікації, денатурація і потім ренатурація призводять до того, що половина молекул обмінюється ланцюгами: оскільки дволанцюговий розрив має різне положення у продуктах ампліфікації, утворюються дві циркулярні молекули з одноланцюговими розривами. Після трансформації у бактеріальну клітину лінійні молекули (друга половина матеріалу) руйнуються бактеріальними нуклеазами, а одноланцюгові розриви в циркулярних молекулах репаруються. У результаті відбувається клонування послідовності-мішені, яка містить замінену нуклеотидну пару.

Велика кількість білків (у тому числі, ферменти, що використовуються у рекомбінантних технологіях) виробляються шляхом експресії у бактеріальних клітинах. Поряд із прокаріотичними розробляються й використовуються також системи експресії рекомбінантних білків в еукаріотичних клітинах. Особливо важливими еукаріотичні системи експресії є для еукаріотичних білків, що не можуть бути синтезовані бактеріальною клітиною в активній формі. Зокрема, це стосується білків, що піддаються суттєвим посттрансляційним модифікаціям – наприклад, глікопротеїдів.

Методи аналізу структури й експресії генів та геномів

Блот-гібридизація

Рис. 11.11. Блот-гібридизація.

Саузерн-блотинг. Потужнім засобом аналізу складних сумішей ДНК щодо наявності там специфічних елементів послідовності є блот-гібридизація на нітроцелюлозних фільтрах за Саузерном (Edward Southern). Назва процедури, яку схематично зображено на рис. 11.11, походить від слова blotting (промакування): фрагменти ДНК розділюються за допомогою гель-електрофорезу (залишаючись невидимими у гелі), після чого на гель накладають нітроцелюлозний фільтр, а під та над цим “сендвічем“ розміщують фільтрувальний папір і занурюють нижній шар паперу в лужний розчин. Під дією капілярних сил розчин піднімається до верхнього шару паперу, “захоплюючи“ при цьому ДНК і переносячи її з геля на нітроцелюлозу. Одночасно при цьому ДНК денатурується лугом. У результаті одноланцюгова ДНК опиняється на фільтрі – середовищі, придатному для подальшої гібридизації, а сам фільтр є точною реплікою вихідного геля. Так само можна перенести ДНК на нітроцелюлозу, застосувавши електрофорез у поперечному напрямі – з геля на фільтр. Далі проводять обробку фільтра зондом – одноланцюговим фрагментом ДНК певної послідовності, який містить радіоактивну мітку. Зонд гібридизується з комплементарною ДНК у певних досі невидимих смугах, що можна зафіксувати за допомогою авторадіографії.

У такий спосіб можна встановити, наприклад, наявність у геномі додаткових копій послідовності, що є гомологічними до вже відомої; присутність у невивченому геномі генів, гомологічних відомим генам; присутність специфічних послідовностей ДНК у препаратах, що отримані з білково-нуклеїнових комплексів. Прикладом одного з численних застосувань Саузерн-блотингу є метод так званого фингерпринтингу ДНК (DNA fingerprinting). Метод базується на факті наявності в еукаріотичних геномах мінісателітних повторів (див. розділ 4) – невеликих елементів послідовності, що тандемно повторюються у різних місцях генома кілька разів. Розподіл локусів по кількості повторів є індивідуальним – так само, як відбитки пальців. З метою ідентифікації особини (чи особи – у криміналістиці, судових справах тощо) геномну ДНК обробляють рестриктазою, що не має своїх сайтів всередині повтору. Фрагменти розділюються шляхом електрофорезу, здійснюється блотинг і гібридизація з радіоактивно-міченим елементом послідовності мінісателіта. У результаті на авторадіограмі представлено специфічний для особини набір фрагментів різної довжини, тобто різної кількості повторів мінісателіта – своєрідний молекулярний відбиток (DNA fingerprint).

Нозерн-блотинг відрізняється від описаної процедури блотингу за Саузерном лише тим, що на гель для електрофорезу наноситься сумарний препарат виділеної мРНК. Гібридизація з міченим фрагментом ДНК (наприклад, кДНК з бібліотеки клонів) дозволяє встановити наявність певної мРНК (тобто, активність гена) у клітинах певного типу, після дії активуючих/репресуючих факторів тощо, а також оцінити рівень цієї активності (концентрацію мРНК) за інтенсивністю забарвлення смуги на авторадіограмі. Назва методу (nothern) є просто жартівливою аналогією з буквальним значенням прізвища Саузерна.

Вестерн-блотинг – назва, що продовжує цю аналогію – це метод переносу білків з геля після електрофорезу на фільтр з метою аналізу складних білкових сумішей. Фільтр обробляють антитілами, специфічними до певного білка, далі міченими (наприклад, флуоресцентною міткою) антитілами до цих антитіл. Практично, це єдиний спосіб детектувати наявність малої кількості конкретного білка у тотальному білковому препараті.