Секвенування днк

Клонований або ампліфікований фрагмент ДНК можна дослідити у різний спосіб, але найбільш вичерпну інформацію дає встановлення нуклеотидної послідовності (sequence) фрагмента – секвенування.

Рис. 11.8. Секвенування ДНК за Сангером: схема синтезу ДНК у присутності дидезоксиАТР (ліворуч). Аналогічна процедура для інших трьох дидезоксинуклеотидів дає набір одноланцюгових фрагментів, що аналізуються за допомогою гель-електрофорезу в денатуруючих умовах (праворуч) – розподіл смуг дозволяє прочитати послідовність (праворуч внизу).

На рис. 11.8 представлено схему найбільш популярного сьогодні методу Сангера (Frederick Sanger). До одноланцюгової ДНК-матриці додається радіоактивно мічений праймер, повний набір дезоксинуклеозидтрифосфатів (dNTP), ДНК-полімераза та невелика кількість дидезоксинуклеозидтрифосфату одного з чотирьох типів (наприклад, ddATP). Дидезоксинуклеотид відрізняється тим, що містить атом Н замість ОН-групи не тільки при 2'-, а також і при 3'-атомі пентози (див. рис. 3.2). Відповідно, включення такого нуклеотида у ланцюг, що синтезується, призведе до зупинки подальшого зростання ланцюга внаслідок відсутності 3' ОН-групи на його кінці (див. рис. 3.4). Оскільки ddATP присутній у невеликій кількості, така подія буде відбуватися у різних точках ланцюга – в усіх, де стоїть аденін напроти тиміну в складі матриці. Денатурація продуктів реакції дасть набір мічених одноланцюгових фрагментів від праймера до кінцевого аденіну, і довжина цих фрагментів у нуклеотидах дасть порядковий номер аденіну в складі ланцюга.

З метою визначення довжини фрагментів проводять гель-електрофорез у денатуруючих умовах, на сусідні лунки геля наносять також продукти синтезу у присутності інших дидезоксинуклеотидів. Як показано на рис. 11.8, після електрофорезу та візуалізації смуг з такого геля можна прочитати нуклеотидну послідовність.

В іншому методі секвенування – методі Максама-Гилберта (Allan M. Maxam, Walter Gilbert) замість ферментативного синтезу використовується хімічне розрізання ланцюга на нуклеотиді певного типу. Отримані фрагменти різної довжини так само розділюються за допомогою електрофорезу.

Метод Сангера використовується сьогодні автоматичними секвенаторами, в яких замість радіоактивно-мічених застосовуються флуоресцентно-мічені праймери. Для кожної з чотирьох реакцій беруть чотири різних флуоресцентних мітки, що випромінюють світло у різних спектральних діапазонах. Продукти всіх чотирьох реакцій наносять на гель для електрофорезу разом. Сканування геля після електрофорезу лазерним променем, що збуджує флуоресценцію, дозволяє дискримінувати продукти різних реакцій (тобто, різні кінцеві нуклеотиди) і, таким чином, негайно прочитати послідовність.

Здійснення секвенування кожного з фрагментів, що містяться у геномній бібліотеці клонів, і порівняння послідовностей фрагментів, що перекриваються (рис. 11.5), дозволяє розмістити клоновані фрагменти у порядку їх локалізації у геномі – тобто, встановити повну послідовність геному.

Останнім часом з'явилася нова перспектива секвенування ДНК у процесі протягування молекули через нанопору. Пóра діаметром ~1 нм утворюється у кремнієвій мембрані, і одноланцюгова ДНК досить повільно проходить крізь цю пору під дією електричного поля. Виявилося, що характеристики електричного струму через мембрану залежать від того, який нуклеотид знаходиться в порі в даний момент. Є сподівання, що розвиток цього методу дасть можливість швидкого та дешевого секвенування генома однієї конкретної людини.