Створення та скринінг геномних бібліотек

Ми розглянули вище принципи клонування фрагмента ДНК. Але звідки береться цей фрагмент? Насправді, для того, щоб працювати з певною ділянкою ДНК (наприклад, певним геном) спочатку здійснюють клонування великої кількості різноманітних фрагментів геному – створюють бібліотеку клонів, серед яких вже шукають потрібний.

Рис. 11.5. Метод дробовика.

Стандартна процедура створення бібліотеки – метод дробовика (shotgun) – розпочинається з часткової (протягом обмеженого часу) обробки всієї геномної ДНК певною рестриктазою – так, щоб отримати набір різноманітних фрагментів, що перекриваються, середньої довжини ~20 000 пар основ (рис. 11.5). Усі такі фрагменти вбудовуються у вектори, і здійснюється трансформація. Бактерії висіваються на тверде середовище так, що кожна колонія веде походження від однієї клітини. Таким чином, набір колоній – це набір різноманітних клонів, кожен з яких містить один з фрагментів геному.

Аналогічно створюють бібліотеки клонів кДНК (комплементарна ДНК-копія молекули мРНК). Для цього спочатку виділяють сумарну мРНК із клітин певного типу. Використовуючи зворотну транскриптазу та oligoT, що комплементарні до 3'-кінцевих polyA-хвостів мРНК, у якості праймерів, на цих мРНК синтезують комплементарні ланцюги ДНК. Видаляють ланцюг РНК РНК-азою і добудовують другий ланцюг ДНК за допомогою фрагмента Кленова ДНК-полімерази І. Далі отримані молекули кДНК піддаються клонуванню. На відміну від геномної бібліотеки, бібліотека клонів кДНК містить тільки кодуючі послідовності (екзони) генів і тільки таких генів, які є активними в клітинах даного типу.

Рис. 11.6. Гібридизація клонованої ДНК із радіоактивним зондом на нітроцелюлозному фільтрі.

Потрібну нуклеотидну послідовність серед бібліотеки клонів можна знайти за допомогою гібридизації клонованої ДНК із радіоактивно-міченим ДНК-зондом (рис. 11.6). Колонії бактерій у чашці Петрі переносяться на нітроцелюлозний фільтр – робиться своєрідна репліка. Здійснюється лізис клітин, депротеїнізація та денатурація ДНК у лужному розчині. Після висушування фільтра одноланцюгова ДНК необернено фіксується на ньому. Фільтр обробляють радіоактивно-міченою ДНК певної послідовності – зондом. Якщо зонд є комплементарним до ДНК клону, відбувається гібридизація – ренатурація дволанцюгової ДНК. Детектування цього факту за допомогою авторадіографії дозволяє ідентифікувати клон, що розшукується.

Зрозуміло, що описаний скринінг бібліотеки клонів залежить від наявності зонда. Одна з можливостей приготувати зонд базується на відомостях про амінокислотну послідовність білка того гена, клон якого потрібно відшукати (або білка-гомолога іншого організму). Хімічний синтез короткого олігонуклеотида (~20 нуклеотидів) із послідовністю, що відповідає фрагменту амінокислотної послідовності білка і тому має бути комплементарною до ділянки ДНК клона, дозволяє отримати зонд. Після внесення радіоактивної мітки такий олігонуклеотид можна використати для гібридизації. Але, зважаючи на виродженість генетичного коду, бажано синтезувати набір послідовностей, які відповідають усім можливим комбінаціям кодонів для даної ділянки послідовності амінокислот. Суміш таких альтернативних олігонуклеотидів, один з яких є напевно комплементарним, і використовують у якості зонда.

Замість синтезу набору олігонуклеотидів можна обійтися синтезом лише одного зонда, використовуючи базу даних EST (Expressed Sequence Tag). База є загально доступною колекцією великої кількості коротких (200-400 пар основ) фрагментів послідовностей кДНК кількох організмів. Достатньо знайти в EST-базі коротку ділянку, що відповідає фрагменту послідовності білка, і синтезувати її, щоб приготувати зонд.