Гель-електрофорез

Після виділення клонованого рекомбінантного вектора та розрізання його рестриктазою постає проблема відокремити фрагмент ДНК від вектора. Найбільш популярним засобом для цього є гель-електрофорез – метод, що є надзвичайно важливим для молекулярної біології взагалі й тому заслуговує на особливу “інтерлюдію“.

Рис. 11.4. Розділення фрагментів ДНК за розміром шляхом гель-електрофорезу. Праворуч – окремі зони, що містять розділені фрагменти.

Принцип електрофорезу є дуже простим (рис. 11.4). Суміш фрагментів ДНК (або РНК) наноситься у лунку пластинки геля – середовища, сформованого полімерною сіткою. Зазвичай гель виготовляється на основі агарози або поліакриламіду. Через гель пропускають електричний струм, і негативно заряджені молекули нуклеїнової кислоти рухаються в електричному полі. Полімерна сітка геля створює для цього руху суттєвий опір, якій долається тим легше, чим меншим є розмір фрагмента. У результаті через певний час фрагменти розділюються на окремі зони – смуги геля, що містять гомогенний набір фрагментів одного розміру. Для візуалізації смуг гель забарвлюють флуоресцентним барвником (найчастіше використовують бромистий етидій), який зв'язується з ДНК. Після цього смугу можна вирізати з геля, та екстрагувати ДНК.

Гель-електрофорез широко використовується також і як аналітичний засіб з метою з'ясування складу суміші. Для візуалізації смуг (особливо якщо розділюються невеликі кількості ДНК) часто застосовують радіоактивне мічення ДНК шляхом введення радіоактивного ізотопу ³²Р у склад 5'-кінцевих фосфатних залишків. Після електрофорезу здійснюється авторадіографія: на гель накладається фотоплатівка, що засвічується напроти смуг завдяки їх радіоактивності. Альтернативою до авторадіографії є експонування геля на спеціальний фосфорний екран, який потім сканується сполученим із комп'ютером приладом – фосфоріміджером. Крім вищої, у порівнянні з авторадіографією, чутливості, використання фосфоріміджера має ту перевагу, що дозволяє зі значно вищою точністю оцінювати кількість матеріалу в смузі.

У найпростішому варіанті – для розділення фрагментів дволанцюгової ДНК за розміром – найчастіше використовують агарозні гелі. Поліакриламідний гель (ПААГ) має значно більш різноманітне застосування. Зокрема, саме ПААГ використовують для розділення сумішей білків. Найбільш популярним є варіант електрофорезу білків у присутності додецилсульфату натрію – зарядженого детергента, що розгортає поліпептидний ланцюг і вкриває його своєрідною “шубою“. У результаті відбувається розділення ланцюгів різної довжини за принципом, що ілюструє рис. 11.4.

На рухливість макромолекул під час електрофорезу впливає також їх форма. Відповідно, за допомогою електрофорезу можна розділити, зокрема:

• молекули ДНК, що містять перманентні вигини, обумовлені особливою послідовністю пар основ – вигнута ДНК більшою мірою гальмується полімерною сіткою геля;

• циркулярні та лінійні молекули ДНК, а також окремі циркулярні топоізомери (див. розділ 3), оскільки вони розрізняються за ступенем компактності;

• молекулу вільної ДНК та комплекс цієї ДНК з білком – звичайно, комплекс більше гальмується сіткою геля.

Особливим варіантом електрофорезу нуклеїнових кислот є електрофорез одноланцюгових фрагментів ДНК у денатуруючих умовах (підвищена температура, висока концентрація сечовини). Якщо такий гель (поліакриламідний) є досить тонким (~0,4 мм – так званий секвенуючий гель), він дозволяє розділити фрагменти, що розрізняються за довжиною на один нуклеотид.