Методи дослідження окремих макромолекул

Більшість методів дослідження (за винятком мікроскопії різних типів) передбачає роботу з досить великою кількістю – ансамблем – однакових молекул. Останнім часом розвиваються методи, що дозволяють слідкувати за поведінкою окремих (звичайно, досить великих) макромолекул та макромолекулярних комплексів: ДНК та її комплексів з білками, хроматинової фібрили, акто-міозинової фібрили тощо.

Рис. 11.19. Принципова схема експерименту з ДНК за допомогою магнітного пінцета.

Одним з прикладів таких підходів є застосування магнітного пінцета (magnetic tweezers). У випадку ДНК (рис. 11.19), молекули (довжиною ~5 000 пар основ чи більше) пришиваються за один кінець до покривного скельця мікроскопа, за інший – до парамагнітної кульки ~2 мкм у діаметрі. Розмір кульки дозволяє слідкувати за нею (тобто, за індивідуальною молекулою ДНК) за допомогою звичайного оптичного мікроскопа. Кулька знаходиться у полі електромагніта, який можна переміщувати або обертати, як показано на рис. 11.19, прикладаючи тим самим зовнішню силу до кінця молекули. Відповідь на зміну зовнішньої сили, що проявляється у відстані кульки від скельця (детектується відеокамерою), несе інформацію про еластичні властивості молекули, тобто – про сили, що цю молекулу стабілізують.

За допомогою підходів такого типу отримано цінну інформацію, зокрема, про жорсткість ДНК щодо розтягування та кручення, структурні особливості деяких білково-нуклеїнових комплексів, конформаційні перебудови нуклеосом, тонкі механізми роботи РНК-полімерази у реальному часі.

Контрольні запитання

1. У чому полягає процес клонування ДНК? Яким вимогам має відповідати плазмідний вектор для клонування і чому?

2. Що таке рестриктази і як вони використовуються у рекомбінантних технологіях?

3. Поясніть принцип й охарактеризуйте основні типи гель-електрофорезу.

4. Що таке геномна бібліотека? Як створюються такі бібліотеки?

5. Що таке кДНК? Як створюють бібліотеку клонів кДНК?

6. Що таке гібридизація? Як здійснюється гібридизація ДНК на нітроцелюлозних фільтрах?

7. Опишіть основні принципи полімеразної ланцюгової реакції.

8. Як здійснюють секвенування ДНК за Сангером?

9. Опишіть принципову схему експресії рекомбінантних білків у бактеріальних клітинах.

10. Що таке блот-гібридизація? Яка різниця між Саузерн-, нозерн- та вестерн-блотингом?

11. Як здійснюють фінгерпринтинг ДНК?

12. Як можна визначити стартові та кінцеві точки транскрипції?

13. Як аналізують активність геному за допомогою ДНК-мікроареїв?

14. Що таке футпринтинг ДНК?

15. Як і з якою метою здійснюють імунопреципітацію хроматину?

16. Охарактеризуйте основні фізичні методи дослідження біологічних макромолекул.

17. Що таке гіперхромний ефект? Як він використовується?

17. Яким чином можна з'ясувати просторову структуру макромолекули з високою роздільною здатністю?

Рекомендована література

1. Глик Б., Пастернак Дж. (2002) Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Москва: Мир.

2. Кантор Ч., Шиммел П. (1984) Биофизическая химия. В 3-х т., Москва: Мир.

3. Остерман Л. А. (2002) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Москва: МЦНМО.

4. Branden C.-I., Tooze J. (1999) Introduction to protein structure. 2^nd ed., New York: Garland Science.

5. Cheung V.G., Morley M., Aguilar F., Massimi A., Kucherlapati R., Childs G. (1999) Making and reading microarrays. Nature Genetics Supplement, 21, 15-19.

6. Chiu W. (1986) Electron microscopy of frozen, hydrated biological specimens. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 15, 237-257.

7. Cooke R.M., Cambell I.D. (1988) Protein structure determination by nuclear magnetic resonance. Bioessays, 8, 52-56.

8. International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 409, 860–921.

9. Leibowitz M. J., Barone F. P., Georgopoulos D. E. (1991) In vitro protein synthesis. Meth. Enzymol., 194, 536-545.

10. Lesk A.M. (2002) Introduction to bioinformatics. New York: Oxford University Press.

11. Lionnet T., Dawid A., Bigot S., Barre F.-X., Saleh O.A., Heslot F., Allemand J.-F., Bensimon D., Croquette V. (2006) DNA mechanics as a tool to probe helicase and translocase activity. Nucl. Acids Res., 34, 4232-4244.

12. PCR Technology: Principle and Applications for DNA Amplification. (1992) H.Erlich, ed. New York: W.H.Freeman and Company.

13. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. 3^rd ed., Cold Spring Harbor, NY: CSHL Press.

14. Service R.F. (1998) Microchip arrays put DNA on the spot. Science, 282, 396-399.

15. Wolfsberg T.G., Wetterstrand K.A., Guyer M.S., Collins F.S., Baxevanis A.D. (2002) A user’s guide to the human genome. Nature Genenics Supplement, 32, 4-79.