Дослідження структури макромолекул у розчині

Вивчити особливості конформаційної рухливості та взаємодії макромолекул у розчині дають змогу різноманітні спектральні методи. Загальний принцип будь-якої спектроскопії полягає у наступному: розчин опромінюється тим чи іншим типом електромагнітного випромінювання, яке мінімально взаємодіє зі зразком. Відповідно, жорстке іонізуюче випромінювання, яке здатне руйнувати ковалентні зв'язки, не є придатним для спектральних досліджень. Різні типи молекулярної спектроскопії використовують діапазони випромінювання, що характеризуються не дуже високою енергією: від ближнього ультрафіолету до високих радіочастот.

Як правило, лише деякі хімічні групи зразка, які можна розглядати як реперні, здатні до специфічної взаємодії з випромінюванням певного типу, і, що є ключовою обставиною, характер взаємодії залежить від мікрооточення цих груп. Певні параметри випромінювання, що змінюються внаслідок його взаємодії з реперними групами, реєструються, і їх інтерпретація дозволяє отримати інформацію про мікрооточення груп, тобто про структуру макромолекули чи, частіше, її перебудови внаслідок зміни умов, взаємодій з іншими молекулами тощо.

Найбільш часто для досліджень макромолекул використовуються спектрофотометрія, круговий дихроїзм, флуоресцентна спектроскопія та ядерний магнітний резонанс.

Спектрофотометр – прилад для вимірювання ефективності поглинання світла в ультрафіолетовій та видимій областях, є неодмінним атрибутом будь-якої молекулярно-біологічної лабораторії. У першу чергу, спектрофотометрія використовується з метою визначення концентрацій молекул: ефективність поглинання є пропорційною до концентрації. Але крім того, ефективність поглинання може залежати від мікрооточення хімічних груп, що відповідають за поглинання – хромофорів. Найбільш яскраво така залежність проявляється для нуклеїнових кислот: поглинання азотистих основ в ультрафіолеті значно знижується за умови реалізації між ними стекінг-взаємодій (див. розділ 3) – так званий гіпохромний ефект. Дослідження денатурації нуклеїнових кислот (плавлення подвійної спіралі) за допомогою протилежного, гіперхромного ефекту (зростання у поглинанні при руйнуванні стекінг-взаємодій) дає інформацію про стабільність подвійних спіралей у залежності від зовнішніх умов, нуклеотидного складу, іноді – особливостей послідовності тощо.

Спектроскопія кругового дихроїзму (КД) базується на різниці у поглинанні оптично-активними молекулами (якими є, зокрема, амінокислоти та нуклеотиди) світла, що є поляризованим по колу ліворуч чи праворуч. Для амінокислот та нуклеотидів така різниця у залежності від довжини хвилі (спектр КД) проявляється у ближній ультрафіолетовій зоні (220–300 нм). Форма спектру КД залежить від взаємної орієнтації однотипних оптично-активних молекул (амінокислот чи нуклеотидів) у складі макромолекули. Відповідно, аналіз спектру дозволяє оцінити відносний вміст різних типів вторинної структури в молекулі білка, зафіксувати структурні перебудови білка, РНК чи ДНК.

Певні хромофори після поглинання світла (збудження хромофора з переходом електрона на вищий енергетичний рівень) здатні втрачати енергію збудження шляхом випромінювання. Випромінювання такого типу, яке називається флуоресценцією, є основою флуоресцентної спектроскопії. У складі біополімерів до флуоресценції в ультрафіолеті здатні дві амінокислоти – Trp та Tyr. Але широке використання флуоресцентної спектроскопії зумовлене, головним чином, великою кількістю синтетичних флуоресцентних зондів (які нековалентно взаємодіють з макромолекулами) та міток (які ковалентно пришиваються до макромолекул). Висока інтенсивність флуоресценції зондів та міток дозволяє, по-перше, детектувати молекули певного типу у невеликих кількостях: у процесі кількісного ПЛР, у гелях після електрофорезу, при гібридизації з ДНК-мікроареями, у живих клітинах за допомогою флуоресцентного мікроскопа. По-друге, різноманітні параметри флуоресценції залежать від мікрооточення зондів, міток та природних білкових хромофорів, що дає багату інформацію про характер конформаційної рухливості макромолекул, структурні перебудови, взаємодію між макромолекулами тощо.

Вимірювання кінетики флуоресценції під час певного процесу (коли процес запускається шляхом швидкого змішування реагентів) дозволяє вивчати тонкі механізми каталітичної активності ферментів, білково-нуклеїнового впізнання, роботи молекулярних моторів. Наприклад, використання флуоресцентних похідних аа-тРНК дозволило досить детально з'ясувати послідовність стадій елонгаційного циклу рибосоми (див. рис. 8.21, 8.25).

Серед різних флуоресцентних підходів особливе місце займає метод резонансного переносу енергії (FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer). Перенос енергії є можливим на відстані для певних пар здатних до флуоресценції хромофорів: як правило, використовуються певні флуоресцентні мітки, що пришиваються до конкретних хімічних груп макромолекули. Одна з міток є донором, інша – акцептором енергії. При збудженні флуоресценції донора перенос енергії можна легко зафіксувати за зменшенням інтенсивності флуоресценції донора та/або зростанням флуоресценції акцептора. Оскільки ефективність переносу залежить від відстані (для різних донорно-акцепторних пар відстань, на якій ефективність переносу дорівнює 50%, варіює у межах ~2-5 нм), метод є ефективною молекулярною “лінійкою“, що дозволяє вимірювати відстані у нанометровому діапазоні та зміни у цих відстанях при структурних перебудовах.

Спектроскопія ядерного магнітного резонансу (ЯМР) використовує той факт, що деякі атомні ядра (зокрема, найчастіше мова йде про ядра гідрогену) мають власний магнітний момент (спін), який орієнтується вздовж зовнішнього постійного магнітного поля. Електромагнітне випромінювання певної частоти у радіочастотному діапазоні здатне змінювати цю орієнтацію на протилежну: відбувається резонансне поглинання енергії, що призводить до зміни магнітних характеристик зразка, яку можна зафіксувати. Значення резонансної частоти залежить від того, до складу якої хімічної групи належить даний гідроген, і якого типу хімічні групи знаходяться поруч. Тобто, спектр ЯМР – залежність ефективності поглинання від частоти – несе інформацію про типи хімічних груп, їх взаємне розташування та ступінь їх рухливості у складі макромолекули.

Особливо цінною є техніка двовимірного ЯМР, коли сигнали резонансу детектують після складної комбінації кількох радіочастотних імпульсів і відображають як функцію двох координат (наприклад, у найпростішому варіанті – частота та інтервал між двома імпульсами). На спектрі такого типу можна розрізнити сигнали гідрогенів різних амінокислот та виміряти зсуви цих сигналів, зумовлені іншими наближеними амінокислотами. Величина зсуву є мірою відстані між амінокислотами: порівняння цієї інформації з амінокислотною послідовністю дозволяє з'ясувати просторову структуру білка. Сьогодні двовимірний ЯМР – єдиний метод, за допомогою якого можна встановити структуру білка у розчині. Нажаль, це можливо тільки для порівняно невеликих білків (до 200 амінокислот) і з роздільною здатністю, трохи гіршою, ніж її дає рентгено-структурний аналіз (~7-10 Å). Проте, оскільки результатом двовимірного ЯМР є набір дуже подібних одна до одної структур, що відображає конформаційну рухливість білка, і оскільки метод у принципі позбавлений можливих артефактів, пов'язаних з кристалічною упаковкою, двовимірний ЯМР є важливим доповненням до рентгено-структурного аналізу. Сьогодні банк даних білкових структур містить більше 36 000 структур, отриманих методом рентгено-структурного аналізу, і більше 6 000 – методом двовимірного ЯМР.

Ще одним важливим доповненням до експериментальних методів вивчення структури макромолекул є комп'ютерні розрахунки в рамках підходу так званої симуляції молекулярної динаміки. Метод розрахунку базується на використанні другого закону Ньютона: F = ma, де F – сила, що діє на частинку, m – її маса, a – прискорення руху частинки. У програму розрахунку вводяться дані про координати атомів макромолекули, отримані методами рентгено-структурного аналізу чи ЯМР. Знаючи силу, що діє на кожен атом (на основі міжатомних відстаней та енергії нековалентних взаємодій різних типів), можна розрахувати прискорення кожного атому в системі. Наступне інтегрування рівнянь руху дає швидкості та траекторії руху атомів як функції часу. Таким чином, розрахунки молекулярної динаміки можуть дати детальну інформацію про флуктуації та конформаційні перетворення білків і нуклеїнових кислот. Застосування методу лімітується потужністю комп'ютерів, але, оскільки вони стають все більш швидкими, метод молекулярної динаміки використовується все ширше. Напевно, найбільшим досягненням на сьогодні є детальний розрахунок на суперкомп'ютері конформаційних перебудов рибосоми під час акомодації аа-тРНК в А-сайті.